干细胞来源的凋亡细胞外囊泡（ApoEVs）中脂质代谢在皮肤伤口愈合中的关键作用

本文揭示了凋亡细胞外囊泡（ApoEVs）中脂质代谢经 sPLA2-X 调节，促进皮肤伤口愈合的机制。

　　

引言

皮肤作为人体最大的器官，在保护身体免受外界侵害方面发挥着至关重要的作用。然而，皮肤缺陷却常常由创伤、肿瘤、烧伤等多种原因引发。大面积的皮肤缺陷，尤其是伴有免疫疾病时，往往会导致伤口愈合延迟，给患者带来极大的痛苦。在探寻皮肤伤口愈合的有效治疗方法过程中，细胞外囊泡（EVs）这种无细胞纳米治疗方法逐渐走进了科研人员的视野。

凋亡细胞外囊泡（ApoEVs）是细胞凋亡后产生的一种 EVs。它如同一个小小的 “包裹”，将来自亲代细胞的内容物密封保存起来，并能把这些内容物传递给吞噬它的细胞。ApoEVs 不仅具备与亲代细胞相似的治疗特性，还在伦理考量、制备方法和一致性方面具有独特优势，因此在多种疾病模型的治疗研究中被广泛探索。尽管已有研究表明 ApoEVs 有助于皮肤伤口愈合，但其治疗效果背后的精确机制仍存在诸多争议，发挥作用的具体成分也尚未明确。

巨噬细胞在免疫系统中是极为关键的 “卫士”，它能够识别并吞噬病原体，同时还能发挥抗炎作用，促进组织的修复与再生。在皮肤损伤过程中，巨噬细胞会被激活，释放肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）。TNF-α 就像一把双刃剑，适量时有助于抵御病原体，但过量时却会引发炎症反应，不仅直接诱导炎症基因的表达，还可能间接导致细胞死亡，与多种炎症性疾病的发生发展密切相关。

细胞外囊泡包含了 DNA、RNA、脂质、细胞质内容物和细胞表面蛋白等多种成分。其中，蛋白质和核酸在细胞间通讯中的作用已被深入研究，但脂质的功能意义却一直未被完全揭示。脂质作为细胞外囊泡的重要组成部分，不仅参与细胞的增殖、凋亡和迁移等过程，还与炎症、过敏、自身免疫疾病等多种病症紧密相连，在炎症的起始和消退阶段发挥着复杂的作用。细胞外囊泡的膜由脂质双层构成，膜中的脂质可以发生水解、氧化等多种化学反应，而磷脂酶作用于脂质产生水解产物，是脂质代谢的重要途径之一。不过，细胞外囊泡中脂质成分对其抗炎特性和组织愈合的贡献，目前仍有待进一步研究。

材料和方法

在这项研究中，科研人员选用了 8 周大的雌性 C57BL/6J 小鼠。这些小鼠来自第四军医大学动物中心，在实验过程中，它们被随机分笼饲养，自由饮食，生活在 12 小时昼夜循环的环境中。所有动物实验都经过了第四军医大学动物使用和伦理委员会的批准。

实验中用到的细胞包括小鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs）、骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）和中性粒细胞。科研人员从 C57BL/6J 小鼠的胫骨和股骨中获取骨髓组织，分别分离培养这些细胞。对于 ApoEVs 的分离，是通过用 0.5 μM 的星形孢菌素（STS）处理 BMMSCs 12 小时诱导细胞凋亡，然后经过一系列离心、清洗步骤，最终将 ApoEVs 保存在 - 80°C 备用。

为了深入探究相关分子机制，研究人员运用了多种实验技术。蛋白质免疫印迹法（Western blot assay）用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平；免疫荧光（Immunofluorescence）技术可以直观观察细胞和组织中目标蛋白的定位和表达；流式细胞术（Flow cytometry）则能精确分析细胞的凋亡状态、吞噬功能以及细胞内炎症因子的表达情况。

研究人员构建了小鼠皮肤伤口愈合模型。他们先给小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，然后在小鼠背部剃毛、消毒，制造直径为 1 cm 的圆形全层皮肤缺损伤口。小鼠被随机分为 PBS 组、ApoEVs 组和 resolvin D5（RvD5）组，分别在伤口处应用含有相应物质的凝胶，并在不同时间点对伤口进行拍照，计算愈合率。

为了研究 sPLA₂-X 对 ApoEVs 的作用，科研人员将 sPLA₂-X 与 ApoEVs 在体外共同孵育，之后离心得到上清液和沉淀物（即 sPLA₂-X 处理的 ApoEVs）。通过一系列实验，观察它们对巨噬细胞吞噬功能的影响。同时，研究人员还进行了吞噬实验，用不同刺激物处理巨噬细胞，检测其对荧光标记物的吞噬情况。

在组织学分析方面，研究人员对皮肤组织进行苏木精 - 伊红染色（HE 染色），在显微镜下观察皮肤组织的结构变化。酶联免疫吸附测定（ELISA）则用于定量检测巨噬细胞上清液中 TNF-α、血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子 -β（TGF-β）等细胞因子的含量。液相色谱 - 质谱联用技术（Liquid chromatography - mass spectrometry，LC-MS）被用来分析 ApoEVs 水解后的代谢产物。最后，研究人员使用 IBM SPSS Statistics 27 软件对实验数据进行统计分析，用 GraphPad Prism 8.0 软件绘制统计图表。

结果

科研人员首先对 ApoEVs 进行了分离和鉴定。他们按照既定的实验流程，用 STS 处理 BMMSCs 诱导凋亡。在显微镜下可以看到细胞出现收缩、核浓缩等凋亡特征。通过流式细胞术分析发现，经 STS 处理后，67.9% 的细胞处于早期凋亡状态，17.8% 的细胞处于晚期凋亡状态，同时凋亡相关蛋白 Cleaved Caspase-3 的表达显著增加。

分离得到的 ApoEVs 在扫描电子显微镜下呈现出球形结构。进一步检测发现，85.84% 的 ApoEVs 表面存在磷脂酰丝氨酸（PS），其粒径大小通过动态光散射（DLS）测定为 953 nm。ApoEVs 能够特异性地与 Annexin V 结合并发出荧光，再次证实了其表面 PS 结构的存在。

将分离得到的 ApoEVs 应用于小鼠皮肤伤口模型后，研究人员发现，与 PBS 组相比，ApoEVs 处理组的伤口愈合速度明显加快。从伤口愈合过程的照片和愈合率统计数据中都能清晰地看到这一差异。对伤口组织进行 HE 染色后发现，ApoEVs 处理组的疤痕更小，皮肤结构更完整，毛囊和胶原蛋白的沉积也更好。

免疫荧光检测显示，ApoEVs 能够被皮肤组织中的巨噬细胞吞噬，在体外培养的巨噬细胞也能摄取 ApoEVs。在炎症细胞模型中，加入 ApoEVs 后，巨噬细胞中 TNF-α 的表达和分泌显著降低，同时 TGF-β 和 VEGF 的分泌增加。这表明 ApoEVs 通过被巨噬细胞吞噬，调节了皮肤损伤处的炎症微环境，促进了组织的再生和伤口的愈合。

研究人员猜测 ApoEVs 的功能可能与磷脂酶 A₂（PLA₂）的水解作用有关，于是选择了在水解哺乳动物细胞膜方面效率较高的 sPLA₂-X，与 ApoEVs 在体外共同孵育。结果发现，sPLA₂-X 处理后的 ApoEVs（X-ApoEVs）能够显著增强巨噬细胞的吞噬功能。

从细胞形态和结构上看，X-ApoEVs 表面出现更多褶皱和突起，粒径减小，表面 PS 表达降低，zeta 电位也发生了变化。通过荧光标记实验发现，与未处理的 ApoEVs 相比，巨噬细胞对 X-ApoEVs 的摄取明显增加。此外，X-ApoEVs 还能显著提高巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬率。

在体内实验中，研究人员发现正常皮肤中 sPLA₂-X 的表达较低，主要集中在毛囊部位。而在皮肤缺损模型中，损伤后 2 天，皮下组织中出现了大量的 sPLA₂-X。Western blot 结果也显示，皮肤组织在损伤 48 小时后，sPLA₂-X 的分泌上调。

进一步研究发现，局部给予 sPLA₂-X 抑制剂 varespladib 后，皮肤损伤处进入血管的 ApoEVs 数量减少。在体外实验中，LPS 刺激能够增强巨噬细胞对 ApoEVs 的吞噬作用，但加入 varespladib 后，这种吞噬功能受到抑制。相反，添加 sPLA₂-X 则能促进巨噬细胞对 ApoEVs 的摄取。这表明 sPLA₂-X 能够增强巨噬细胞对 ApoEVs 的吞噬作用。

文献报道 sPLA₂-X 作用于细胞膜后会释放二十二碳六烯酸（DHA），研究人员推测 ApoEVs 被 sPLA₂-X 水解后也可能释放 DHA。实验结果证实了这一推测，ApoEVs 与 sPLA₂-X 共同孵育后，检测到了 DHA 的释放，且其含量明显高于未处理组。

DHA 可以代谢为专门的促消退脂质介质（SPMs），研究人员通过质谱分析发现，ApoEVs 处理后的培养基中存在 RvD5。将 RvD5 加入巨噬细胞后，巨噬细胞的吞噬功能增强。在 LPS 刺激的巨噬细胞中加入 RvD5，巨噬细胞中 TNF-α 的比例降低，且 RvD5 与 ApoEVs 共同作用时，TNF-α 的比例下降更为显著。将 RvD5 应用于皮肤缺损模型，发现其能够促进皮肤伤口的愈合，使伤口形成更完整的上皮结构和更多的毛囊等皮肤附属结构。

讨论

已有多项研究表明 ApoEVs 能够调节巨噬细胞的功能，进而调节炎症反应，但对于 ApoEVs 降低巨噬细胞分泌 TNF-α 的具体机制，目前存在多种观点。部分学者认为 ApoEVs 通过抑制 NF-κB 通路影响 TNF-α 的分泌，也有研究认为 ApoEVs 促使巨噬细胞从促炎表型转变为抗炎表型来调节炎症因子的分泌。然而，近期研究指出，巨噬细胞炎症表型的转变并不一定意味着炎症的减轻。本研究则提出 ApoEVs 通过水解产生的脂质来调节巨噬细胞的功能和炎症反应。

细胞凋亡过程中，细胞膜表面的 PS 会发生翻转，进而形成 ApoEVs，其独特的 PS 外化结构使其成为磷脂酶作用的潜在靶点。sPLA₂-X 能够优先水解具有 PS 外化结构的膜，这就为 ApoEVs 被 sPLA₂-X 水解提供了可能。本研究中，ApoEVs 经水解后在形态和结构上都发生了明显变化。

以往对 ApoEVs 功能的研究大多认为，ApoEVs 通过其表面分子或内容物直接发挥作用。但本研究发现，ApoEVs 需要 sPLA₂-X 的参与才能更好地发挥功能。sPLA₂-X 在受到刺激后从分泌细胞释放到细胞外，当 ApoEVs 与这些游离的酶分子接触时，就会被激活，释放脂质，调节炎症微环境。这表明 ApoEVs 发挥作用需要特定的外部环境，在炎症环境中，ApoEVs 被 sPLA₂-X 激活，从而维持机体的免疫稳态。

ApoEVs 包含多种成分，但其发挥作用的具体成分尚无定论。已有研究表明，EVs 可以通过 RNA 分子或蛋白质成分发挥生物学功能。本研究则揭示了 ApoEVs 水解后释放的脂质代谢产物具有抗炎特性。由于部分 ApoEVs 含有核成分，存在遗传物质传播的潜在风险，限制了其应用。而明确 ApoEVs 膜成分中的有效脂质后，就有可能直接构建含有有效成分的 ApoEVs。本研究证实了 ApoEVs 产生的脂质 RvD5 具有抗炎作用，这提示可以将 RvD5 整合到人工囊泡中，增强其抗炎功能。不过，ApoEVs 水解产物促进巨噬细胞功能的具体途径仍不明确，ApoEVs 中的其他脂质在免疫调节中可能也发挥着作用，这些都为后续研究提供了方向。

结论

ApoEVs 中的脂质代谢在皮肤伤口愈合过程中起着关键作用。这一过程离不开炎症产生的 sPLA₂-X 的参与，这充分表明 ApoEVs 的功能与周围环境密切相关。本研究不仅加深了人们对 ApoEVs 发挥抗炎作用和促进皮肤缺损修复机制的理解，还为基于 ApoEVs 的皮肤治疗提供了新的理论依据。未来，随着研究的不断深入，有望开发出更高效、更安全的基于 ApoEVs 的治疗策略，为皮肤损伤及相关疾病的临床治疗带来新的突破。