母亲雄激素暴露的男性后代糖尿病易感性的跨代遗传

　　

山东大学（Shandong University）生殖医学与子代健康国家重点实验室等多个单位的研究人员 Yuqing Zhang、Shourui Hu 等在《Cell Discovery》期刊上发表了题为 “Transgenerational inheritance of diabetes susceptibility in male offspring with maternal androgen exposure” 的论文。这篇论文在生殖医学和代谢疾病研究领域意义重大，为深入理解糖尿病的遗传机制以及制定针对性的预防策略提供了关键依据。

研究背景

在全球范围内，代谢疾病的负担日益沉重，尤其是儿童和青少年群体，其中 2 型糖尿病（T2D）和肥胖症导致的死亡率居高不下。越来越多的证据表明，生命早期暴露于不良的宫内环境，会对个体成年后的代谢健康产生深远影响，这种现象被称为健康与疾病的发育起源（DOHaD），且相关风险可能跨代遗传。

母体激素环境的扰动，特别是性激素，被认为是影响胎儿发育编程的重要因素。雄激素在女性 2 型糖尿病的发病机制中扮演着重要角色，与代谢功能障碍密切相关。母体雄激素水平受外源性环境暴露和内源性疾病的共同影响。外源性雄激素过量的情况包括滥用雄激素药物，以及接触环境中普遍存在的类固醇模拟化学物质，如双酚 A 和全氟辛酸等；内源性高雄激素血症则常由多囊卵巢综合征（PCOS）、先天性肾上腺增生、库欣综合征或分泌雄激素的肿瘤等常见内分泌疾病引起，全球 20%-28% 的女性受其影响。此外，流行病学研究显示，不同种族和民族的女性在孕期雄激素水平存在差异，西班牙裔、非裔美国人和南亚女性的雄激素水平相对较高，这与糖尿病患病率的增加相关。

值得注意的是，雄激素过量的女性往往会出现一系列代谢紊乱，如肥胖、胰岛素抵抗和胰腺 β 细胞功能障碍，这大大增加了患糖耐量受损和 2 型糖尿病的风险。而且，她们的女儿在成年后也更容易患上生殖系统疾病。尽管动物研究表明，母体雄激素过量会导致雌性后代出现跨代的多囊卵巢综合征样特征，但对雄性后代的跨代代谢影响却知之甚少。因此，深入研究母体雄激素暴露（AE）对雄性后代代谢的跨代影响具有重要的科学意义和临床价值。

研究方法

1. 人类研究：研究获得了山东大学生殖医学中心伦理委员会的批准，遵循赫尔辛基宣言的原则。建立了母婴出生队列，纳入了孕前检测基础激素水平（包括睾酮）的女性。高雄激素血症的定义为循环总睾酮水平≥48.1ng/dL。研究对象的子女通过辅助生殖技术或卵胞浆内单精子注射受孕，在 2014 年至 2021 年出生，并随访至 2023 年。最终分析纳入了 561 名母亲患有高雄激素血症的儿子，并与 1122 名母亲雄激素水平正常的对照儿子按母婴年龄 1:2 匹配。测量了子代的体重、身高以计算 BMI，采集空腹血样检测空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）水平，并计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和胰腺 β 细胞功能指数（HOMA-β）。同时，采集部分儿童的空腹血样用于评估血液 DNA 甲基化水平。

2. 小鼠建模、繁殖和喂养：动物研究同样获得山东大学生殖医学中心伦理委员会批准。选用野生型 C57BL/6 J 小鼠，适应性饲养 2 周后，在特定病原体 - free 条件下饲养。通过给怀孕的 F0 代母鼠在胚胎 E16.5 - E18.5 皮下注射二氢睾酮建立产前雄激素暴露小鼠模型，对照组注射溶剂。F1 代雄性后代与野生型雌性小鼠交配产生 F2 代，依此方式繁殖至 F4 代。对不同代次的雄性小鼠监测代谢表型至 32 周龄。部分小鼠给予高脂饮食（HFD）喂养 12 周诱导肥胖，用于研究肥胖与产前雄激素暴露的联合影响。

3. 热量限制（CR）和二甲双胍（Met）干预：对 AE-F1 小鼠进行 CR 干预，从 16 周龄开始，喂食正常食量的 80%，持续 4 周；另一组 AE-F1 小鼠给予二甲双胍（250mg/kg/ 天）处理 4 周。处理结束后，这些小鼠与野生型雌性小鼠交配产生 F2 代，F2 代小鼠不进行干预饲养。

4. 检测指标与实验技术：定期记录小鼠体重，用双能 X 线吸收法测量体脂肪质量，通过代谢笼进行间接测热法检测能量代谢相关指标，包括能量消耗和呼吸交换比。测量小鼠尾静脉血糖，用 ELISA 试剂盒检测血清或胰腺组织中的胰岛素水平。进行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）评估小鼠的糖耐量和胰岛素敏感性。通过胶原酶消化和密度梯度离心法分离小鼠胰岛，进行胰岛素分泌实验。对胰腺组织进行免疫荧光和组织学染色，用 western blot 检测相关蛋白表达水平。采用全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）分析精子 DNA 甲基化情况，RNA 测序（RNA-seq）分析胰岛转录组变化，甲基化 DNA 免疫沉淀 - 定量 PCR（MeDIP-qPCR）验证关键基因的 DNA 甲基化水平。

研究结果

1. 母体高雄激素血症诱导雄性后代早期代际和跨代葡萄糖代谢紊乱：基于山东大学生殖医学中心的出生队列研究发现，与母亲雄激素水平正常的儿子相比，母亲患有高雄激素血症的儿子 HOMA-β 水平显著升高，提示其胰腺 β 细胞功能异常的风险增加。在小鼠实验中，建立了产前雄激素暴露小鼠模型，对 F1 - F4 代雄性小鼠进行研究。8 周龄时，AE-F1 雄性小鼠空腹血糖水平低于对照组，表现出一定的 β 细胞功能增强，但 AE-F2 雄性小鼠空腹血糖水平显著升高，且这一特征传递至 AE-F3 后代，表明出现跨代高血糖表型。在 IPGTT 实验中，AE-F1 雄性小鼠 8 周龄时血糖水平和曲线下面积（AUC）降低，而 AE-F2 雄性小鼠则升高，处于糖尿病前期状态。这些结果表明，产前雄激素暴露可能在幼年时期就损害雄性后代的代际和跨代葡萄糖代谢稳态。

2. 高龄和肥胖加剧 F1 - F3 雄性小鼠的高血糖和葡萄糖不耐受：对不同年龄阶段的 F1 - F4 雄性小鼠在正常饮食（NCD）条件下监测葡萄糖代谢，发现 AE-F1 雄性小鼠随着年龄增长，空腹血糖水平逐渐升高，16 周龄时与对照组持平，32 周龄时显著高于对照组。这种随年龄增长的高血糖趋势在 F2 和 F3 代中同样存在。在 IPGTT 实验中，AE-F1 雄性小鼠 8 周龄时糖耐量改善，但 16 周龄后血糖水平和 AUC 显著增加，32 周龄时恶化更为明显；F2 代成年 AE 雄性小鼠在各评估年龄均表现出显著的糖耐量受损；F3 代雄性小鼠 8 周龄时糖耐量正常，但 16 周龄后血糖水平开始升高。给予子代小鼠高脂饮食后，AE-F1 和 AE-F2 雄性小鼠的空腹高血糖情况加剧，AE-F1 雄性小鼠的糖耐量受损更为严重，且这种受损的糖耐量还传递至 F3 代。不过，F4 代雄性小鼠在高脂饮食下，血糖水平和糖耐量的差异不再明显，提示 F3 代小鼠的生殖系可能丢失了高血糖性状的遗传信息。

3. 产前雄激素暴露导致雄性后代跨代糖尿病易感性的原因是胰腺 β 细胞功能受损：8 周龄的 AE-F1 雄性小鼠 HOMA-β 水平显著升高，血清胰岛素水平在腹腔注射葡萄糖后也显著增加，胰岛素生成指数升高，体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验显示其胰岛素分泌增强，表明早期 β 细胞功能亢进。但到 32 周龄时，AE-F1 小鼠的这些指标均显著下降，GSIS 实验显示胰岛素分泌减少。F2 代 AE 雄性小鼠从 8 周龄开始就表现出 HOMA-β 水平降低、胰岛素释放减少和 GSIS 受损，同时胰腺免疫荧光和胰岛素含量测量显示 AE-F1 和 AE-F2 胰岛中的胰岛素水平明显降低，表明胰岛素合成减少。这些数据表明，AE 后代的跨代糖尿病易感性主要源于胰腺 β 细胞功能受损。

4. 产前雄激素暴露改变精子中与胰岛素分泌相关的 DNA 甲基化：对 F1 代对照和 AE 雄性小鼠的精子进行 WGBS 分析，虽然两组的整体 CG 甲基化水平和模式无显著差异，但鉴定出 16,805 个高甲基化和 19,924 个低甲基化的差异甲基化区域（DMRs），这些 DMRs 主要位于基因间区域、内含子、CpG 岛和外显子。DMRs 对应的基因进行 KEGG 通路富集分析发现，胰岛素分泌和 2 型糖尿病相关通路显著富集。对差异甲基化胞嘧啶（DMCs）的分析也得到了类似结果。对 F2 代对照和 AE 雄性小鼠胰岛进行 RNA-seq 分析，并结合 F1 代精子的 WGBS 数据进行综合分析，发现胰岛素分泌是两个数据集共有的最显著富集的代谢通路。这表明 AE-F1 精子中差异甲基化的基因，尤其是与胰岛素分泌相关的基因，对高血糖表型的表观遗传遗传至关重要。

5. 从 AE-F1 精子到 AE-F2 胰岛持续存在的 DNA 甲基化变化导致 β 细胞功能基因表达受抑制：分析 F1 精子 DMR 相关基因与 F2 胰岛差异表达基因（DEGs）的重叠情况，发现有 296 个重叠基因，这些基因在胰岛素分泌通路中显著富集。其中，Pdx1、Irs1、Ptprn2、Kcnma1、Cacna1c 等参与胰岛素分泌的基因在 AE-F2 胰岛中选择性下调，而抑制胰岛素分泌的 Cnr1 和 Pde1c 则显著上调。MeDIP-qPCR 分析验证了这些关键基因在 AE-F1 精子中的 DNA 甲基化异常，且这些基因的甲基化变化在胚胎 E18.5 的胰腺和成年 F2 胰岛中持续存在。同时，AE-F2 胰岛中 PDX1、IRS1、PTPRN2 和 CACNA1C 的 mRNA 和蛋白质表达水平显著降低。进一步追踪发现，AE-F2 精子保留了关键 β 细胞功能基因的差异 DNA 甲基化，但 AE-F3 精子中这些差异不再存在，这与代谢表型的传递模式一致。

6. AE-F1 精子与 2 型糖尿病患者共有的甲基化特征在 AE 儿子的血液中得到验证：将 AE-F1 精子中差异甲基化的基因与 2 型糖尿病患者胰岛和发病前血液中的 DNA 甲基化变化进行比较，发现了 8 个共同的差异甲基化基因，如 PFKFB3、PHGDH、PLAGL1 等，这些基因与 β 细胞功能调节或成年发病型糖尿病相关。对母亲患有高雄激素血症的儿子血液样本进行 MeDIP-qPCR 分析，发现其中 5 个甲基化标记（PFKFB3、PHGDH、SLC1A5、BSN 和 POR）在 AE 儿子的血液中显著改变，且与 AE-F1 精子中的变化一致，表明这些甲基化特征可作为早期生物标志物，用于筛查代谢高风险儿童，预测未来患 2 型糖尿病的易感性。

7. CR 和 Met 改善 AE-F1 雄性小鼠的代谢功能障碍并阻断其向后代的传递：对 16 周龄已出现糖耐量受损的 AE-F1 小鼠分别进行 CR 和 Met 干预。结果显示，AE-CR 和 AE-Met 组小鼠体重显著下降，空腹和餐后血糖水平降低，糖耐量和胰岛素敏感性显著改善。将干预后的 F1 小鼠与正常雌性小鼠交配产生 F2 代雄性后代，发现 CR 和 Met 干预使 AE-F2 雄性小鼠的空腹和餐后血糖恢复到正常水平，糖耐量也得到正常化，表明 CR 和 Met 不仅能纠正 AE-F1 代小鼠的高血糖缺陷，还能阻断其向 F2 代的传递。

8. CR 和 Met 恢复 AE 后代小鼠 β 细胞功能基因的异常 DNA 甲基化和表达：对 F1 代对照、AE、AE-CR 和 AE-Met 小鼠精子进行 MeDIP-qPCR 分析，发现 CR 和 Met 干预使 AE 小鼠精子中 Pdx1、Irs1 和 Kcnma1 等关键胰岛素分泌基因的 DNA 甲基化水平显著恢复正常，其他一些基因的甲基化也有恢复趋势。对 Pdx1、Irs1 和 Cacna1c 等 β 细胞功能基因的蛋白质表达水平进行检测，发现 AE-F2 小鼠胰岛中这些基因的蛋白质水平显著降低，而经过 CR 和 Met 干预后，其蛋白质水平完全恢复正常。这表明 CR 和 Met 可通过恢复雄激素暴露雄性小鼠的 DNA 甲基化模式，阻断 β 细胞功能障碍向后代的传递。

研究结论与讨论

本研究表明，母体雄激素暴露是影响后代 β 细胞功能的代际和跨代决定因素，会使后代更容易患糖尿病。通过对跨代小鼠的研究发现，产前雄激素暴露的 F1 - F3 代雄性后代随着年龄增长和高脂饮食的影响，会出现高血糖和葡萄糖不耐受，主要原因是胰岛素分泌缺陷。F1 精子和 F2 胰岛中的 DNA 甲基化变化是 β 细胞功能受损跨代遗传的基础，且在 AE 小鼠、2 型糖尿病患者和 AE 儿子的血液中发现了共同的甲基化变化，这些变化有望作为 2 型糖尿病风险的生物标志物。此外，CR 和 Met 干预可有效预防高血糖的跨代传递。

糖尿病已成为全球公共卫生问题，威胁着近 5 亿人的健康。本研究基于临床母婴队列和跨代小鼠模型，有力地证明了母体雄激素暴露是后代 β 细胞功能障碍的触发因素，并传递了跨代 2 型糖尿病风险，这极大地推进了对糖尿病病因的理解。研究还揭示了母体雄激素暴露与衰老、肥胖等代谢应激因素之间的复杂相互作用，强调了指导合理饮食习惯和建立健康生活方式的重要性，特别是在儿童和青少年中。

DNA 甲基化在跨代遗传中起着关键作用，本研究发现的 β 细胞功能基因的差异甲基化从 F1 精子持续到胚胎胰腺和成年 F2 胰岛，表明这些甲基化标记可能逃避胚胎发育过程中的表观遗传重编程。此外，研究还发现了一些在 AE-F1 精子、母亲患有高雄激素血症的儿子血液以及 2 型糖尿病发病前血液中一致改变的甲基化标记，这表明精子可作为开发表观遗传生物标志物的宝贵来源，用于预测后代患 2 型糖尿病的风险。

目前针对代谢疾病遗传的治疗策略有限，本研究中 CR 和 Met 对改善 AE 小鼠代谢功能的有效性，为高风险人群改善后代代谢健康提供了潜在的临床应用方案。CR 和 Met 可能通过激活 AMPK，调节关键的甲基化和去甲基化酶，重新编程精子的 DNA 甲基化景观，但具体机制仍需进一步研究。

综上所述，本研究揭示了母体雄激素暴露对跨代 β 细胞功能障碍和糖尿病易感性的驱动作用及表观遗传遗传机制，为解决与产前雄激素暴露相关的后代代谢紊乱提供了可行的干预策略，对促进未来世代的代谢健康具有重要意义。