编辑推荐：
猪在生物医学研究意义重大，但对其胚胎骨骼肌发育研究有限。研究人员针对猪胚胎，开展 MYF5/MYOD/MYF6 基因敲除研究。结果显示，敲除导致猪胚胎骨骼肌缺失、发育异常和胚胎致死。该研究为猪肌生成研究及再生医学提供重要依据。
在生物医学研究的广阔领域中，猪作为一种重要的动物模型，正逐渐崭露头角。由于其在解剖学和生理学上与人类有着诸多相似之处，猪在诸如异种移植、人类器官在猪体内发育用于外移植等研究方向上，展现出了巨大的潜力。然而，与其他常用动物模型相比，猪的相关研究却相对滞后，尤其是在胚胎骨骼肌发育方面，存在着大量的未知。目前，虽然对猪胚胎心血管系统和腹部器官的发育研究较为广泛，但对于骨骼肌发育的探索却十分有限，而且针对体细胞核移植（SCNT）产生的猪胚胎研究更是凤毛麟角。同时，肌肉调节因子（MRFs）在猪体内的功能以及骨骼肌基因敲除模型的研究也处于空白状态，这严重限制了人们对猪肌生成的理解，以及猪模型在转化研究中的应用。
为了填补这些知识空白，美国明尼苏达大学（University of Minnesota）等机构的研究人员勇挑重担，开展了一项极具意义的研究。他们通过 SCNT 技术制备了野生型（WT）猪胚胎，并将其与缺乏 MYF5、MYOD 和 MYF6 基因（MYF5/MYOD/MYF6-null）的骨骼肌缺失胚胎进行对比，研究时间点设定在猪肌生成的关键阶段，即胚胎第 41 天、62 天和 90 天。研究结果意义非凡，不仅揭示了猪胚胎发育过程中肌肉和内脏器官系统的动态变化，还明确了 MYF5、MYOD 和 MYF6 基因在猪胚胎骨骼肌发育中的关键作用，为猪肌生成研究提供了重要的理论基础，也为再生医学和外移植科学的发展开辟了新的道路。该研究成果发表在《Communications Biology》杂志上。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过 SCNT 技术制备 WT 和 MYF5/MYOD/MYF6-null 胚胎；然后，在特定胚胎发育阶段采集胚胎并收集组织样本；利用磁共振成像（MRI）观察胚胎内部器官形态发育；采用组织学染色（如 H&E 染色、Masson’s Trichrome 染色）分析骨骼肌组织学特征；运用免疫组织化学技术检测肌源性干细胞和肌肉分化标记物；借助 RNA 测序（RNA-seq）探究基因表达谱变化；还通过对神经肌肉接头（NMJ）相关标记物染色评估 NMJ 发育情况 。
发育动态：克隆 WT 猪胚胎肌肉和内脏器官系统的变化
研究人员在猪肌生成重要阶段（E41、E62、E90）采集克隆 WT 胚胎。MRI 结果显示，E41 时，胚胎身体结构初现，心脏、肺、腹部器官等已可辨认，骨骼肌系统初步发育；E62 时，各器官进一步发育，肺叶更加明显，肾脏皮质髓质区分清晰，肌肉发育使部分肌肉可分辨；E90 时，更多器官结构显现，如膀胱、生殖器官等，骨骼肌和神经系统持续分化。组织学染色表明，E41 时肌肉纤维密集排列，有结缔组织形成；E62 时纤维和束密度增加，出现次级纤维和血管发育；E90 时纤维密度更高，束状结构更有序。通过免疫组织化学和共聚焦显微镜技术研究发现，WT 胚胎骨骼肌发育正常，肌纤维根据不同阶段表达不同的肌球蛋白重链（MyHC）亚型，且肌纤维横截面积和分布在不同阶段呈现特定变化规律，表明克隆 WT 胚胎肌纤维发育成熟过程有序且复杂。
MYF5/MYOD/MYF6 缺失：导致猪胚胎骨骼肌缺失
利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术获得 MYF5/MYOD/MYF6-null 猪胚胎。从 E41 开始，该胚胎就出现明显表型异常，如后墙水肿、肢体发育不良，E62 时这些症状更为严重，E90 时胚胎坏死吸收。MRI 检查发现，虽然其胸腔和腹腔器官发育程度与 WT 胚胎相当，但存在轴向 / 附属系统发育异常、脊柱侧弯、肋骨和胸骨缺失等问题。组织学染色显示，E41 和 E62 时，胚胎后肢肌肉纤维完全缺失，被水肿液替代，结缔组织和血管发育延迟。这些结果表明，MYF5/MYOD/MYF6 基因缺失导致猪胚胎全身骨骼肌缺失。
细胞标记物差异表达：WT 与 MYF5/MYOD/MYF6-null 猪胚胎的对比
免疫组织化学分析显示，WT 胚胎在 E41、E62 和 E90 时，肌源性干细胞（卫星细胞，通过 Pax7 标记）和肌肉分化标记物（Myogenin）均有明显表达，且细胞数量在 E41 到 E62 期间增加，E62 到 E90 期间减少。而 MYF5/MYOD/MYF6-null 胚胎在 E41 和 E62 时，几乎检测不到 Pax7 阳性染色和 Myogenin 阳性细胞，Laminin 和 Dystrophin 表达也显著降低。这表明，MYF5、MYOD 和 MYF6 基因缺失严重影响了猪胚胎肌源性干细胞的存在和肌肉的分化过程。
转录组分析：揭示基因表达差异
对 E41 和 E62 的 WT 和 MYF5/MYOD/MYF6-null 胚胎后肢样本进行 RNA 测序。E41 时，MYF5/MYOD/MYF6-null 胚胎有 1085 个基因上调，1100 个基因下调，其中包括肌肉发育关键调控基因如 MYOG、PAX7 等表达缺失，而肌生成抑制基因如 TWIST1、TWIST2 等上调。E62 时，基因表达异常更为严重，1760 个基因上调，1599 个基因下调，除肌肉结构和纤维发育基因表达缺失外，免疫系统相关基因和 NMJ 发育因子等异位过表达。基因本体（GO）通路分析表明，MYF5/MYOD/MYF6-null 胚胎中肌肉器官和结构发育通路显著下调，而血液和血管发育通路、造血和免疫系统发育通路则上调。这反映出在缺乏骨骼肌发育程序的情况下，胚胎发生了一系列基因表达的代偿性变化。
NMJ 发育异常：MYF5/MYOD/MYF6-null 猪胚胎的神经肌肉接头问题
通过对突触后（乙酰胆碱受体，AChR；α-BTX 标记）、突触前（运动神经元 / 突触小泡；2H3/SV2 标记）和施万细胞（S100 标记）的标记物进行检测，评估神经肌肉接头（NMJ）的发育情况。结果显示，E41 时，WT 胚胎已有 NMJ 形成，但较为稀疏和无序；而 MYF5/MYOD/MYF6-null 胚胎几乎没有 AChR 簇，施万细胞发育也明显滞后。E62 时，WT 胚胎 NMJ 形成更加稳定，而 MYF5/MYOD/MYF6-null 胚胎仍缺乏 AChR 染色，没有明显的 NMJ 形成迹象。到 E90 时，WT 胚胎骨骼肌中神经模式更加有序，AChR 簇结构更成熟。这表明，MYF5、MYOD 和 MYF6 基因缺失严重破坏了猪胚胎 NMJ 的正常发育。
综上所述，该研究全面深入地探究了 WT 猪胚胎在妊娠中期的发育和骨骼肌肌生成过程，以及 MYF5、MYOD 和 MYF6 基因缺失对猪胚胎表型的影响。研究结果表明，MYF5、MYOD 和 MYF6 基因在猪胚胎骨骼肌发育、卫星细胞维持、NMJ 形成以及胚胎存活方面起着至关重要的作用。MYF5/MYOD/MYF6-null 猪胚胎表现出严重的肌肉骨骼缺陷、卫星细胞缺失、NMJ 形成受阻和胚胎致死等现象。这项研究不仅填补了猪肌生成研究领域的诸多空白，还为深入理解哺乳动物骨骼肌发育机制提供了重要参考。同时，MYF5/MYOD/MYF6-null 猪模型的建立，为外源性供体肌肉生成、人类肌源性干细胞分离以及再生医学和外移植科学的发展提供了独特而有价值的平台，有望推动相关领域的进一步突破和发展。
