探秘神经元的多样世界：转录组学揭示神经元的奥秘

斑马鱼视觉顶盖神经元的转录组学分析鉴定了60多种细胞类型；功能成像显示，特定细胞类型的响应调节、形态和连通性随着神经元在组织中的位置而系统地变化。

　　

探秘神经元的多样世界：转录组学揭示神经元的奥秘

在生命科学的微观世界里，神经元（神经系统的基本结构和功能单位）犹如繁星般神秘而复杂。德国马克斯?普朗克生物智能研究所（Max Planck Institute for Biological Intelligence）的 Inbal Shainer、Johannes M. Kappel 等研究人员，在顶尖学术期刊《Nature》上发表了题为 “Transcriptomic neuron types vary topographically in function and morphology” 的论文。这一研究成果犹如一把钥匙，为我们打开了深入理解神经元世界的大门，在神经科学领域具有举足轻重的意义。它让我们对神经元的功能、形态以及它们与基因之间的关系有了更清晰的认识，有望为未来神经系统疾病的治疗和神经科学的发展提供全新的思路和方向。

研究背景：解开神经元身份的谜题

神经元可以根据其表达的基因组合被分为不同的类别、类型和亚型。细胞类型特异性转录组（t - type）被认为编码了神经元在发育过程中的分化轨迹，进而决定其形态（m - type）、连接性和功能（f - type）。以秀丽隐杆线虫为例，其 118 种在解剖学上不同的神经元类型，每种都表达独特而稀疏的转录因子组合，这些转录因子调节下游基因，塑造了神经元的表型并影响其对网络功能的贡献。在果蝇中，不同的差异表达基因集与特定的轴突或树突布线相关。同样，在小鼠视觉皮层中，单个 t - type 内的形态电特性相对一致。

然而，传统观点认为 t - type、m - type 和 f - type 等价存在问题。因为功能反应以及树突或轴突的分支往往受到调节影响和可塑性机制的塑造。例如，视觉皮层中的 GABA 能（γ - 氨基丁酸表达）中间神经元的调谐特性取决于行为状态而非 t - type。而且，相同 t - type 的小鼠皮层神经元在功能调谐和 m - type 上可能存在很大差异，表现出不同的长程投射和局部连接。因此，确定影响神经元表型表达的外在因素以及它们与转录组的相互作用至关重要。

斑马鱼的视顶盖（optic tectum，OT）是研究这一问题的理想模型。它接收来自视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的拓扑组织输入，并将视觉输入转化为运动输出。OT 在功能上存在区域特化，尽管视拓扑图是连续的，但不同亚区域具有不同功能。此外，OT 的发育过程中，外在因素（包括形态发生素、趋化因子和细胞表面因子）在浓度和可用性上沿三个轴（前后、背腹和浅深）以及发育过程中发生变化，这些因素可能以位置依赖的方式影响 OT 神经元的表型。

研究方法：开启微观世界的钥匙

单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）

研究人员对 6 - 7 天受精后的斑马鱼幼体的 OT 进行基于液滴的单细胞 RNA 测序。他们仔细解剖出 OT 半球和纵束，经过细胞解离等一系列精细操作，最终将解离的细胞加载到商业单细胞条形码系统上进行文库制备和测序。之后，对测序数据进行严格的质量检查、批次校正和聚类分析，成功识别出多种细胞类型，包括祖细胞、放射状胶质细胞、神经元和其他非神经元群体。这一技术就像是一台微观世界的 “高清相机”，让研究人员能够清晰地看到每个细胞的基因表达情况，为后续研究奠定了坚实基础。

多重和迭代原位杂交链反应（HCR）

HCR 实验在特定的转基因斑马鱼幼体上进行。幼体经过麻醉、固定等处理后，与 HCR 探针和发夹结构进行杂交反应。通过这种方法，研究人员可以检测特定基因的表达，并通过迭代染色和成像，深入研究基因表达的空间模式。这一技术如同给基因加上了 “定位追踪器”，让研究人员能够准确地知道不同基因在大脑中的表达位置。

功能成像和细胞形态分析

利用双光子功能钙成像技术，研究人员记录 6 - 8 天受精后的 Tg (elavl3:H2b - GCaMP6s) 斑马鱼幼体 OT 神经元的活动。在实验过程中，幼体被嵌入琼脂糖中，接受一系列视觉刺激，如不同方向移动的点、光栅、明暗变化等，同时记录神经元的钙信号。此外，研究人员还构建了敲入转基因系，并对单个神经元进行稀疏标记和形态分析，追踪神经元的形态并将其注册到标准脑图谱上。这一系列操作就像是给神经元的功能和形态做了一次全面的 “体检”，让研究人员能够深入了解它们的特点和规律。

研究结果：神经元世界的奇妙发现

顶盖细胞类型在分子层面具有多样性

通过单细胞 RNA 测序，研究人员对斑马鱼 OT 的 t - type 组成进行了深入研究。他们共测序了 45766 个细胞，将其分为 25 个主要簇，并进一步鉴定出 66 种神经元 t - type，包括 33 种兴奋性神经元和 33 种抑制性神经元。这些神经元类型通过差异表达基因来定义，部分神经元类型有独特的标记基因，而其他类型则通过稀疏的差异表达基因组合来明确。与之前的研究相比，此次研究方法涵盖了所有顶盖细胞，能够识别出更丰富的神经元和非神经元群体，为我们展现了一个更加丰富多彩的神经元世界。

t - types 呈拓扑排列

研究人员通过选择差异表达基因并利用 HCR 技术检测其空间表达模式，发现基因鉴定的神经元在 OT 的浅深（SD）轴特定区域富集。例如，GABA 能和谷氨酸能神经元分别主要分布在 SPV 的最深层和最浅层，胆碱能神经元则位于两者之间。通过对神经元质心位置的分析和最近邻距离（NND）的测量，研究人员发现 SPV 可分为浅、中、深三个不同层次，这表明 t - types 在空间上呈拓扑排列，且细胞类和细胞类型的发育可能遵循预定顺序，兴奋性 t - types 通常先于抑制性 t - types 发育。这一发现让我们对神经元在大脑中的分布规律有了更清晰的认识，就像是发现了神经元世界里的 “地理版图”。

组合模式通过轴细化 t - types

研究人员对由标记基因组合定义的转录组亚型的空间组织进行了研究。以 atf5b 和 sp5l 基因为例，通过对其共表达基因的分析发现，无论是单一标记还是组合编码定义的簇，都沿 SD 轴在空间上分离，而沿 SPV 前后轴的分布与神经发生因子和神经元从后缘增殖区的分化进程有关。这一结果进一步揭示了神经元类型在空间组织上的复杂性和精细调控机制，仿佛看到了神经元在发育过程中遵循着一套精密的 “导航图”。

单个 t - types 内的视觉反应存在差异

研究人员通过双光子体积成像记录神经元的钙活动，并结合 HCR 标记确定神经元的 t - type。他们发现，平均 t - type 反应对至少两种刺激的得分高于总体平均反应，且同一 t - type 内的神经元在视觉调谐上并不一致，但与其他 t - types 相比，功能上平均更相似。例如，atf5b 型神经元对移动的点和光栅有强烈反应，而 itpr1b 神经元对逼近和 OFF ramp 刺激得分较高。这表明即使是具有相同转录组特征的神经元，在功能上也存在多样性，它们就像一群有着相似外表但性格各异的 “小居民”，各自承担着不同的功能。

转录组和位置决定功能

研究人员对 OT 中的功能反应类型（f - type）进行聚类分析，发现没有一种 f - type 特定于或高度代表某一种 t - type，但特定的 t - types 在 f - type 超簇中局部富集。通过将相同 t - type 和 f - type 的记录神经元分组为 t/f - 簇并分析其解剖分布，研究人员发现 t/f - 簇在解剖上往往沿前后轴分离，这表明细胞体在 OT 中的位置强烈影响其功能表型。此外，研究还发现细胞体位置比功能特征更能预测 t - type 身份，这为我们理解神经元的功能和身份之间的关系提供了新的视角，仿佛找到了一把解读神经元功能密码的 “新钥匙”。

转录组和位置决定形态

研究人员对特定 t - type 的神经元进行稀疏标记和形态分析，发现同一 t - type 的神经元在形态和连接性上存在差异，且这些差异沿 OT 的前后轴以位置依赖的方式排列。例如，cort 神经元大多是抑制性室周中间神经元，但在分层模式上存在多种类型；itpr1b 神经元位于神经毡，具有多种分层形态；atf5b 和 sp5l 兴奋性神经元包括不同投射模式的神经元和中间神经元。这一结果表明转录组和位置共同决定了神经元的形态，神经元的形态就像它们的 “个性签名”，受到多种因素的影响而各不相同。

研究结论与讨论：照亮神经科学的灯塔

这项研究通过对斑马鱼 OT 的深入研究，揭示了转录组、发育和拓扑结构之间的相互作用对神经元表型的影响。研究结果表明，转录相似的神经元在功能、形态和连接性上可能存在差异，外在的位置依赖因素扩展了遗传相似神经元的表型库。在 OT 这样的拓扑地图区域，转录组细胞类型在视觉反应和形态上存在重叠，这可能反映了其输入和输出的异质性，与视觉处理适应刺激统计的特性相关。

神经元的发育过程也对其表型产生重要影响。OT 中较晚出生的神经元更靠近后缘，可能接收来自鼻侧视网膜的不同信息，拥有不同的突触伙伴，导致电路布局不对称。而且，细胞表面和轴突导向分子在发育过程中的瞬时表达，进一步增加了转录上难以区分的神经元的表型多样性。

这些发现对神经科学领域具有重要意义。它更新了我们对神经元细胞类型的认识，表明细胞类型不仅取决于转录组，还需要基于位置和发育进行进一步分层，才能更准确地预测其功能和形态。尽管基因可区分的 t - types 数量庞大，但空间和时间限制的信号可以产生更多基因编程电路的表型变体。这一研究为未来神经科学研究指明了方向，有助于我们更深入地理解神经系统的发育、功能和疾病机制，就像一座灯塔，照亮了神经科学前行的道路，为开发针对神经系统疾病的新疗法和干预措施提供了理论基础。