挖掘宏基因组 “暗物质”：一种新型金属酶助力纤维素高效转化

　　

挖掘宏基因组 “暗物质”：一种新型金属酶助力纤维素高效转化

近期，巴西可再生能源国家实验室（Brazilian Biorenewables National Laboratory，LNBR）等多单位的研究人员在《Nature》杂志上发表了题为 “A metagenomic ‘dark matter’ enzyme catalyses oxidative cellulose conversion” 的论文。这一研究成果在生物质转化、可持续能源等领域具有重要意义，为解决生物质利用难题、推动向可持续生物经济转型提供了新的思路和方法。

一、研究背景

纤维素作为地球上最丰富的可再生聚合物，其生物解聚过程面临诸多挑战。尽管它由葡萄糖残基构成，但结晶微纤维结构以及与木质素、半纤维素在植物细胞壁中的紧密结合，使得纤维素对降解具有高度抗性，自然分解过程缓慢，且依赖复杂的多组分酶系统。

传统上，基于对丝状真菌和细菌的广泛研究，纤维素降解的经典模型包括内切 -β - 葡聚糖酶（endo-β -glucanase）、纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase）和 β - 葡萄糖苷酶（β -glucosidase）这三种主要水解活性。不过，随着研究的深入，人们发现了如裂解多糖单加氧酶（lytic polysaccharide monooxygenases，LPMOs）等氧化还原酶也参与其中，并且这些水解和氧化还原酶可以存在于大型细胞结合的多酶复合物（如纤维小体，cellulosomes）或无细胞的多模块蛋白质中。然而，由于大多数微生物在实验室条件下难以培养，它们的遗传潜力仍未得到充分挖掘，这促使研究人员探索新的途径来发现和理解参与纤维素降解的微生物和酶。

二、研究方法

（一）宏基因组和生物信息学方法

研究人员从巴西圣保罗州夸塔市（Quatá）一家糖厂收集了长期被甘蔗渣覆盖的土壤样本以及附近未覆盖甘蔗渣的对照土壤样本。通过机械去除表面甘蔗渣层，从土壤表面和 20 厘米深度采集样本，立即冷冻在液氮中并储存于 -80°C。接着，利用 FastDNA Spin Kit for Soil 试剂盒提取微生物 DNA，对 16S rRNA 基因的 V4 区域进行扩增和测序，并构建宏基因组文库进行短读长和长读长测序。随后，对原始序列进行质量控制、从头组装、分箱以及功能注释等一系列生物信息学分析。

（二）酶的发现与表征

从属于未培养细菌门 UBP4 的 “Candidatus Telluricellulosum braziliensis” 的基因组中，利用隐马尔可夫模型筛选出与已知碳水化合物处理蛋白有一定序列相似性但在 CAZy 数据库中无匹配的序列，进行合成、在大肠杆菌中表达并纯化。通过对多种底物的活性筛选，包括多糖、寡糖和合成底物，评估其对底物的作用能力；同时开展糖化促进筛选，以评估这些蛋白对里氏木霉（Trichoderma reesei）Br_TrR03 纤维素酶鸡尾酒糖化效率的影响。

（三）结构和计算生物学方法

通过蒸汽扩散法获得 CelOCE 的晶体，利用 X 射线衍射技术收集数据，以 RoseTTAFold 生成的模型为搜索模型，通过分子置换法解析晶体结构，并进行精修。运用分子对接和计算模拟，研究 CelOCE 与底物的相互作用模式。

（四）遗传工程和里氏木霉表征

采用定制的 CRISPR-Cas9 方法，将编码 CelOCE 和 LsAA9A 的基因整合到里氏木霉 Br_TrR03 菌株的基因组中。对工程菌株进行摇瓶培养、 bench-scale 生物反应器培养和中试规模生物反应器培养，分析其分泌蛋白组，进行糖化实验和酶活性分析。

三、研究结果

（一）一种纤维素氧化裂解酶

对甘蔗渣覆盖土壤的宏基因组分析发现，与附近原生植被的对照土壤相比，该环境中的微生物多样性显著降低，但与多糖分解和代谢途径相关的宏基因组组装基因组（MAGs）数量增加。从高质量的 MAGs 中，研究人员聚焦于 “Candidatus Telluricellulosum braziliensis”，对其编码的蛋白进行筛选。其中一种蛋白能增强里氏木霉纤维素酶鸡尾酒对预处理甘蔗渣的解聚能力，且该蛋白对多种底物无水解活性，在氧化还原条件下作用于木质纤维素、微晶纤维素和无定形纤维素时，仅产生纤维二糖酸，表明其为一种非水解性的纤维素氧化裂解酶，命名为 CelOCE。序列相似性网络（SSN）和系统发育分析显示，CelOCE 在多种与生物质降解相关的细菌和古菌中存在同源物，且与已知参与抗生素生物合成或糖醛酸代谢的蛋白属于不同的功能簇。

（二）同源二聚体单铜结构

解析 CelOCE 的晶体结构发现，它采用紧凑的果冻卷折叠（compact jelly-roll fold），形成背靠背的同源二聚体，每个亚基含有一个处于扭曲八面体配位环境的铜原子。通过同步辐射 X 射线荧光（XRF）、X 射线吸收光谱（XAS）、等温滴定量热法（ITC）和电子顺磁共振（EPR）等多种技术，证实了铜的存在以及其与蛋白的结合特性。与 LPMOs 不同，CelOCE 的铜配位环境和 EPR 谱具有独特性，且其活性中心埋在口袋状结构中，位于扁平界面，适合与纤维素相互作用。

（三）电子供体和共底物

研究表明，CelOCE 的纤维素氧化裂解活性严格依赖电子供体，如抗坏血酸（ascorbic acid，ASC）。在无氧和无过氧化氢的情况下，即使存在还原剂，该酶也无活性；但在厌氧条件下，添加 ASC 和外源过氧化氢时，CelOCE 表现出活性，且在有氧条件下和厌氧添加过氧化氢条件下，其氧化产物的生成周转率相似。这表明原位产生的过氧化氢不是 CelOCE 催化的限速因素，其同源二聚体结构可能有助于自身产生过氧化氢，一个亚基与纤维素相互作用时，另一个亚基可作为原位过氧化氢供应者。

（四）对纤维素的外切型作用机制

结构和计算分析显示，CelOCE 具有独特的活性位点拓扑结构，其催化铜深埋在由多个氨基酸残基形成的口袋中，该口袋可容纳二糖，且与葡萄糖基部分立体化学兼容。在与纤维寡糖的模拟复合物中，非还原端葡萄糖基残基与 E96 和 Q50 相互作用， -1 葡萄糖基残基与 F33 堆叠，使 C1 原子靠近催化铜，有利于氧化攻击，从而产生纤维二糖酸。此外，铜结合位点附近的刚性环与 C 末端 α - 螺旋和第二个 N 末端 β - 链形成扁平表面，与纤维素相互作用。通过生成 F33A 变体酶，验证了这种结合模式和外切型作用机制。

（五）在生物质转化中的协同作用

评估 CelOCE 与关键纤维素酶的协同作用发现，它与内切型纤维素酶（如 GH5 和 GH45 内切葡聚糖酶）具有显著的加和效应，但与外切型纤维二糖水解酶 Cel7A 无正效应，这与 CelOCE 的外切型作用模式一致。将编码 CelOCE 的基因整合到里氏木霉 Br_TrR03 基因组中，工程菌株分泌的酶在工业相关条件下，能显著提高预处理甘蔗渣和桉树木材材料的葡萄糖释放量，且效果优于表达真菌 AA9 LPMO（LsAA9A）的同一菌株，证明了 CelOCE 在生物质转化中的潜力。

四、研究结论与讨论

本研究发现的 CelOCE 为纤维素降解提供了一种创新的氧化还原机制。其独特的铜配位环境、扁平的催化界面和同源二聚体结构，使其能够以一种前所未有的外切型机制特异性地裂解纤维素，仅释放纤维二糖酸，并且通过原位产生过氧化氢促进反应进行。这种酶与水解内切纤维素酶具有协同作用，能够显著促进纤维素的解聚。

CelOCE 在生物技术领域具有诸多优势。它仅由 115 个氨基酸残基组成，是碳水化合物酶学中发现的最小的催化活性蛋白之一，其紧凑的结构和独特的铜配位方式，有利于生物工程改造和人工酶设计。通过在里氏木霉中与纤维素酶和半纤维素酶共表达，CelOCE 显著提高了预处理木质纤维素生物质的葡萄糖释放量，且在中试规模生物反应器中成功生产，展现了其工业应用潜力。

此外，该研究揭示了铜催化的过氧化物酶反应在除 LPMOs 之外的其他生物催化剂中也存在，这拓展了人们对氧化还原生物化学的认识。通过深入了解细菌参与碳水化合物分解和代谢的氧化还原系统，有助于进一步理解全球碳循环的机制，为农业工业残留物转化为高附加值的生物产品提供了新的途径，推动了向可持续生物经济的转型。

总的来说，这项研究成果不仅在基础科学层面加深了人们对纤维素降解酶的理解，还为生物质转化相关的生物技术产业发展提供了有价值的理论基础和实践指导，具有重要的科学意义和应用前景。