质谱流式细胞术助力高通量多重血清学检测研究解读

　　

近日，来自斯坦福大学（第一作者单位）的研究人员在《Nature Biomedical Engineering》期刊上发表了一篇题为 “High-throughput multiplexed serology via the mass-spectrometric analysis of isotopically barcoded beads” 的论文。这一研究成果在血清学检测领域具有重要意义，为公共卫生管理和传染病防控提供了新的技术手段，有望打破传统血清学检测的局限，实现更高效、准确的检测。

一、研究背景

血清学免疫分析作为检测生物样本中特异性抗体的有力工具，在疫苗疗效监测、流行病学监测、病毒传播动态研究、疾病诊断以及药物研发等诸多领域发挥着关键作用。然而，在面对大量样本需针对多个目标进行评估时，现有血清学检测方法的可扩展性成为重大瓶颈。以新冠疫情为例，迫切需要精确、高通量、低成本、快速且能重复检测，同时所需样本量小的血清学检测技术。

经典的酶联免疫吸附试验（ELISA）虽因操作简便、灵敏度高和特异性强而被广泛应用，但它每次仅能对单个样本的单一分子靶标进行检测，受成本和时间限制，严重阻碍了高通量应用。近年来，自动化策略和多重血清学技术虽提高了检测通量，如 Luminex 检测中使用的荧光团条形码微珠可同时检测单个样本中的多种分析物，但荧光团的光谱重叠问题限制了可用条形码数量，进而制约了基于荧光微珠的血清学检测的可扩展性。尽管有策略改善了荧光微珠光谱重叠等问题，但目前其条形码空间仍有限。因此，开发可大幅超越现有条形码限制的技术，对研究和临床应用意义重大。

二、研究材料与方法

（一）临床样本

研究使用了多种临床样本，包括来自斯坦福血液中心 2020 年 4 月至 5 月 COVID-19 康复血浆捐赠者的样本，用于图 3c、d 相关研究；从 Discovery Life Sciences 购买的经 RT-PCR 检测确诊为 SARS-CoV-2 感染的 COVID-19 阳性样本，用于图 3e、f；来自 FIND COVID 研究（由美国疾病控制与预防中心资助，对旧金山湾区近期确诊 SARS-CoV-2 感染个体的纵向队列研究）的样本，用于图 4；以及从 Solomon Park 购买的 2019 年 11 月（COVID-19 大流行正式开始前）之前收集的大流行前样本，用于图 3 和图 4。所有样本均经过去识别化处理，且研究得到了相关机构审查委员会的批准。

（二）关键技术路线

1. 稳定同位素标记聚苯乙烯微珠的合成后策略：为实现高通量基于微珠的质谱流式细胞术检测，需满足每颗微珠均匀且高负载同位素，以及可扩展地生成大量同位素条形码微珠这两个条件。研究人员通过将同位素偶联的生物素化蛋白质与链霉亲和素包被的聚苯乙烯微珠结合，成功实现了每颗微珠高负载同位素且标记均匀。他们将稳定同位素镝 162（）偶联到生物素化牛血清白蛋白（BSA）上，并负载到链霉亲和素包被的微珠上，经质谱流式细胞术检测，证实了该方法的有效性。随后，将此方法扩展到 37 种其他稳定同位素，成功实现了 38 种稳定镧系同位素在聚苯乙烯微珠合成后的均匀、可调且高负载掺入。

2. 生成数千个同位素条形码聚苯乙烯微珠的高通量策略：设计双条形码策略，每个微珠包含两组同位素，一组用于识别分子靶标，另一组用于识别样本。利用 18 种同位素，通过先从 6 种同位素中选择 3 种为第一组生成 20 个条形码，再从 12 种同位素中选择 6 种为第二组生成 924 个条形码，最终生成 18480 个条形码。开发自动解码流程，能准确识别微珠事件的双条形码特征，实现了数千个同位素条形码微珠的高通量生成及其在混合样本中的可靠识别。

3. 低样本量血浆抗体检测的双微珠选择系统：设计双微珠选择系统，一个微珠用稳定同位素预定义组合条形码标记并负载感兴趣的生物素化抗原，另一个为磁性微珠且偶联抗人免疫球蛋白。仅当存在识别靶抗原的抗体时，条形码微珠与磁性微珠才会交联。临床血浆样本与负载不同抗原的条形码微珠孵育，洗涤后与磁性微珠孵育，通过质谱流式细胞术分析流穿液中条形码微珠数量与基线微珠混合物中数量的比值，评估宿主抗体水平。

4. 高通量免洗多重抗体检测系统：设计由连续固定和变性步骤组成的免洗系统，消除同位素条形码微珠血清学检测中的洗涤限制。抗原负载的同位素条形码微珠与样本孵育使宿主抗体结合，用多聚甲醛固定抗体，十二烷基硫酸钠处理使结合和未结合的免疫球蛋白变性，样本混合洗涤后，与同位素标记的二抗孵育，最后通过质谱流式细胞术分析结合的宿主抗体水平。

三、研究结果

（一）合成后策略实现稳定同位素高效标记微珠

通过将同位素偶联的生物素化蛋白质与链霉亲和素包被的聚苯乙烯微珠结合的合成后策略，成功实现了 38 种稳定镧系同位素在聚苯乙烯微珠上的均匀、高负载掺入。质谱流式细胞术分析显示，标记后的微珠每颗都有高负载同位素且标记均匀，即使不同同位素在电感耦合等离子体质谱中通常具有不同的传输因子，各同位素的强度仍相似。对负载不同量生物素化蛋白质载体并偶联和的微珠池分析，揭示了预期的九种微珠群体，证实了该系统的可调性、灵活性和稳健性。

（二）双条形码策略生成大量可识别微珠

利用双条形码策略成功生成 18480 个条形码，并开发了自动解码流程。从三个独立批次的条形码微珠分析来看，每次运行平均有个事件，能准确解码 72.9%±10.97% 的微珠事件（第二组 12 种同位素中有 6 种正确签名），其中 85.29%±8.91% 的微珠事件第一组 6 种同位素中有 3 种正确签名。准确解码的微珠事件可按第一组条形码分组为 20 组，每组内又可按第二组条形码进一步分为 924 组，且第二组 924 个条形码的微珠计数呈正态分布，18480 个条形码均能 100% 回收，证明了该策略在高通量生成和识别同位素条形码微珠方面的有效性。

（三）双微珠系统实现低样本量抗体检测

基于双微珠选择系统的检测方法，用重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白 S1 亚基（spike S1）负载的条形码微珠与 COVID-19 康复者和阴性对照血浆样本孵育，结果与预期的血清免疫模式一致。在多次独立实验中结果相似，且与 ELISA 和流式细胞术结果相符，验证了该系统检测患者血浆样本中抗体的有效性。进一步分析更多血浆样本发现，该系统能以 100% 成功率区分 COVID-19 患者和阴性对照，部分样本中仅用 1nl 样本就能检测到针对 spike S1 的抗体，还揭示了患者特异性的 SARS-CoV-2 抗体谱差异。

（四）免洗系统实现高通量多重抗体检测

免洗系统通过连续固定和变性步骤，成功消除了洗涤限制，可同时分析 924 个样本中针对 19 种 SARS-CoV-2 蛋白变体的 IgG 和 IgM 水平。对旧金山 SARS-CoV-2 感染家庭队列的 542 个纵向血清样本分析显示，该检测结果与临床使用的免疫分析方法（如 Abbott AdviseDx SARS-CoV-2 IgG II）相关性良好，且能检测到样本中针对不同 SARS-CoV-2 变体的独特抗体反应特征，证明了该方法的定量、敏感和特异性，以及在大规模检测中的可行性。

四、研究结论与讨论

研究人员成功开发了一种高度可扩展的多重血清学技术，通过质谱流式细胞术实现检测。该技术生成了 18480 个独特条形码，利用自动解码流程处理原始数据，无需用户定义参数。运用微珠选择方法，在小样本量（低至 1nl）中检测到针对 SARS-CoV-2 spike S1 的 IgG 抗体，并同时分析了 924 个样本中针对 19 种蛋白的 IgG 和 IgM 水平，一次检测相当于进行 36960 次 ELISA 式血清学检测，大幅提高了检测通量，降低了成本，减少了操作人员的操作时间。

通过对 FIND 队列中体液免疫的评估，将该血清学检测方法与临床批准的免疫分析方法进行对比，结果表明该质谱流式细胞术检测能够可靠地检测出 SARS-CoV-2 变体特异性特征。该技术可通过生产所需重组蛋白，轻松扩展到检测 SARS-CoV-2 的其他抗原变体及其他目标。对免疫球蛋白亚类的全面表征结合纵向检测，有助于揭示免疫机制，为疫苗接种策略提供信息。未来，可利用剩余同位素空间在每个微珠上同时评估更多免疫球蛋白亚型，进一步拓展样本分析深度；还可将检测扩展到其他具有关键生物学意义的样本来源，如鼻黏膜、牙龈沟等。

从技术角度看，当前基于同位素的血清学检测主要受可用条形码数量和采集速度限制。虽有超过 50 种同位素可用于质谱流式细胞术，但本研究仅同时使用了 20 种，增加条形码数量时需考虑不同同位素在电感耦合等离子体质谱中的传输因子差异，谨慎进行验证。同时，提高检测通量还需进一步实现检测的微型化和自动化。此外，蛋白纯化的可扩展性限制了抗原面板的组装，尽管商业抗原的可用性缓解了这一问题，但在组装新抗原面板时仍需进行广泛验证。

总体而言，这项研究设计并实施的血清学技术快速、高通量且成本效益高，为在人群规模上分析体液免疫反应开辟了新途径。该技术在政府主导的血清学监测、药物研发、疫苗接种监测、自身免疫性疾病和癌症诊断以及传染病爆发时免疫保护相关性监测等领域具有广阔的应用前景，有助于从系统层面揭示体液免疫机制，为治疗策略的开发和临床结果的预测提供指导。