一个优化的粪便microRNA测序管道揭示了毛滴虫感染中的纤维化

在这里，Layton等人描述了一种通过分析粪便microrna来研究肠道疾病的非侵入性方法，揭示了慢性蠕虫感染中的肠道纤维化。

　　

优化粪便 microRNA 测序流程揭示小鼠鞭虫感染中的纤维化机制

近日，来自英国曼彻斯特大学（The University of Manchester）的 Emma Layton 等人在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “An optimised faecal microRNA sequencing pipeline reveals fibrosis in Trichuris muris infection” 的研究论文。该研究开发了一种优化的粪便 microRNA（miRNA）检测方案，确定了健康小鼠中可重复的粪便 miRNA 谱，并揭示了在小鼠鞭虫（Trichuris muris）感染过程中，miRNA 在纤维化和伤口愈合方面的作用。这一研究为深入理解肠道疾病发病机制、开发非侵入性诊断方法和新的治疗策略提供了重要依据。

研究背景

肠道具有消化、营养吸收、免疫监视和微生物共生等多种功能。肠道 miRNA 可在粪便中检测到，其在调节肠道屏障完整性、宿主 - 微生物相互作用和免疫反应方面发挥关键作用，有望成为研究肠道健康的非侵入性工具。此前，已有研究利用微阵列和 qPCR 技术研究粪便 miRNA，主要集中在结直肠癌和炎症性肠病领域，发现特定 miRNA 的改变可作为疾病诊断、严重程度和预后的指标。然而，这些研究在样本存储、miRNA 分离和数据分析等方面存在较大异质性，限制了研究结果的可重复性和实用性。尽管高通量小 RNA 测序技术已用于检测人和小鼠粪便 miRNA 谱，但目前对粪便样本中 miRNA 谱的可重复性，以及在健康和稳态下的稳定性了解有限。

研究材料与方法

实验动物

选用 6 - 8 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠，购自 Charles Rivers laboratories（英国）。实验前，小鼠共同饲养 2 周。将小鼠随机分为感染组（n = 7）和对照组（n = 5），感染组通过口服灌胃感染约 25 个 Trichuris muris（爱丁堡菌株）虫卵，对照组灌胃等量的水。小鼠饲养环境为温度 22°C ± 1°C、湿度 65%，12 小时光照 - 黑暗循环，自由获取食物和水。

样本采集与处理

直接将粪便颗粒收集到 750 μl 预冷的 RNAlater? 中，于 4°C 保存，并在 24 小时内使用 mirVana? miRNA 分离试剂盒提取总 RNA。若首次提取的核糖体条带不清晰，则在 24 小时内重复提取。提取的总 RNA 于 - 80°C 保存，用于后续测序。

文库构建与测序

使用 NEBnext 小 RNA 文库制备试剂盒，以 500 ng 总 RNA 为输入，按照制造商的说明构建小 RNA 测序文库。扩增进行 12 个 PCR 循环，通过 Novex 6% TBE 凝胶进行大小选择。样本混合后，在 Illumina Hiseq4000 平台上进行 76 bp 双端测序。研究中产生的粪便小 RNA 测序数据已存入 NCBI 基因表达数据库，登录号为 GSE267555。

数据分析

运用 Cutadapt 软件去除测序接头、过滤质量并筛选 18 - 26 个核苷酸长度的 reads。先将小 RNA reads 与 tRNA 和 rRNA 进行比对，去除匹配的 reads，再将剩余 reads 映射到小鼠基因组（mm10）。利用 Subread 软件的 featureCounts 函数对小鼠 miRNA 进行定量，通过 DESeq2 软件的 counts () 函数进行标准化处理。差异表达分析采用 DESeq2 软件的 DESeq 函数，使用 Wald 检验计算统计显著性，Benjamini - Hochberg 错误发现率校正，调整后的 p 值 < 0.05 视为差异表达。运用 Ingenuity Pathway Analysis 对感染后第 35 天差异表达 miRNA 的预测 mRNA 靶标进行功能分析。

细胞实验

将 NIH - 3T3 小鼠成纤维细胞接种过夜，用 10 ng/mL 重组小鼠转化生长因子 β1（TGF - β）处理，并同时转染 50 nM 的 mirVana?模拟物、抑制剂或 cy3 标记的阴性对照 miRNA。实验结束后收集细胞培养上清液，于 - 80°C 保存，用于细胞因子分析。采用 qPCR 检测成纤维细胞中 α - 平滑肌肌动蛋白（α - SMA）和 I 型胶原蛋白（Col1）的表达水平，通过共聚焦显微镜观察 Col1 的表达情况，利用 Luminex 分析检测细胞培养上清液中的细胞因子。

组织检测

采用 Hyperion? 成像质谱细胞技术对感染和未感染小鼠的盲肠组织进行纤维化评估。组织切片经脱石蜡、抗原修复、封闭后，与金属偶联的一抗孵育过夜，再与二抗孵育，最后用 DNA 嵌入剂染色，在成像质谱细胞仪上进行检测。

研究结果

优化文库制备流程提高 miRNA 产量

研究人员对粪便小 RNA 测序方案进行优化，测试不同的粪便颗粒储存条件，发现将粪便颗粒在 4°C 下保存在 RNAlater 稳定缓冲液中，即可获得高质量的总 RNA，无需进行速冻处理。通过对自身数据与已发表小鼠粪便小 RNA 测序数据的荟萃分析，发现优化后的方法每个样本的平均标准化 miRNA 读数最高，比产量第二高的研究高出 23.5%，且检测到的 miRNA 种类多样。这表明优化后的样本和文库制备条件较为理想，能有效提高 miRNA 的产量和检测种类。

健康小鼠粪便 miRNA 谱在不同研究中具有可重复性

通过比较本研究中健康对照组（I0）、Liu 等人研究中的未免疫组和 He 等人研究中的健康未处理组（DSS0）的粪便 miRNA 谱，发现 30 种独特的 miRNA 出现在三项研究的前 20 位，其中 12 种在所有三项研究中均一致。最丰富的 miRNA 是 miR - 21a - 5p，同时 miR - 200 家族和 let - 7 家族成员也在高丰度下可重复检测到。这说明健康小鼠的粪便 miRNA 谱在不同研究中具有较好的可重复性。

健康小鼠粪便 miRNA 谱随时间的动态变化

研究在三个时间点（I0、N21 和 N35）对健康野生型小鼠的粪便 miRNA 进行分析，发现前 20 种最丰富的 miRNA 在这些时间点上显著一致，其中前三种（miR - 21a - 5p、miR - 192 - 5p 和 miR - 148a - 3p）保持不变，且每个时间点可重复检测到 18 种。尽管 miRNA 组成高度保守，但表达水平随时间有显著变化，同一家族的 miRNA 表现出相同的表达模式。

慢性感染导致粪便 miRNA 差异表达

比较感染和未感染小鼠在实验第 21 天和第 35 天的粪便 miRNA 谱，发现第 21 天有 1 种 miRNA（miR - 7a - 5p）显著上调；第 35 天有 7 种高可信度的差异表达 miRNA，其中 3 种（miR - 200c、miR - 23b 和 miR - 5119）显著上调，4 种（miR - 26b、miR - 29a、miR - 103 和 miR - 6966）显著下调。主成分分析表明，第 35 天感染状态是造成粪便 miRNA 谱差异的主要因素。对第 35 天差异表达 miRNA 的预测 mRNA 靶标进行通路分析，发现这些 miRNA 在纤维化发展、伤口愈合、上皮黏附连接信号和紧密连接信号等通路中发挥潜在作用。

差异表达的 miRNA 增加成纤维细胞中的胶原蛋白

将感染第 35 天差异表达最显著的三种 miRNA（miR - 26b、miR - 29a 和 miR - 200c）转染到 TGF - β 刺激的 3T3 成纤维细胞中。结果显示，miR - 29a 模拟物抑制 Col1 表达，miR - 29a 抑制剂使其表达增加 13 倍；miR - 200c 模拟物则显著上调 Col1 表达。这些变化在蛋白质水平也得到了共聚焦显微镜的证实。同时，miR - 200c 模拟物显著降低 Th2 启动细胞因子 CCL2 的产生，增加 Treg 极化细胞因子 LIF 的产生。这表明慢性感染中 miR - 29a 减少和 miR - 200c 增加与胶原蛋白产生增加相关，且 miR - 200c 可能通过调节 T 细胞极化改变免疫反应。

小鼠鞭虫感染盲肠中存在纤维化的证据

利用 Hyperion? 成像质谱细胞技术检测发现，感染小鼠盲肠组织出现广泛重塑，透明质酸、硫酸乙酰肝素和 I 型胶原蛋白的表达显著增加，且增加的 I 型胶原蛋白沉积区域不与 α - SMA 共染色。这一结果支持了粪便 miRNA 参与慢性小鼠鞭虫感染盲肠中胶原蛋白产生和纤维化发展的假设。

研究结论与讨论

本研究开发了一种优化的粪便小 RNA 测序流程，确定了健康小鼠稳定的粪便 miRNA 谱，并通过研究小鼠鞭虫感染模型，揭示了宿主 miRNA 在宿主 - 病原体相互作用中的潜在作用。研究发现，慢性感染会诱导与伤口愈合、屏障完整性和纤维化相关的 miRNA 差异表达，其中 miR - 29a 和 miR - 200c 在调节胶原蛋白产生和免疫反应方面发挥重要作用。尽管目前感染改变粪便 miRNA 的机制尚不清楚，但研究表明饮食、寄生虫分泌的细胞外囊泡等因素可能对其产生影响，这为通过饮食干预调节肠道 miRNA 提供了潜在的治疗途径。

该研究具有重要意义。一方面，优化的粪便 miRNA 测序流程为研究肠道疾病提供了一种可靠的非侵入性方法，有助于开发新的诊断生物标志物和治疗策略；另一方面，对小鼠鞭虫感染中 miRNA 作用的揭示，为理解肠道寄生虫感染的发病机制提供了新的视角，有望推动针对寄生虫感染和相关肠道疾病的研究进展，对改善人类健康具有潜在的应用价值。