编辑推荐：
在生物学研究中，脂质膜的纳米级荧光可视化存在挑战。研究人员开展超微结构膜膨胀显微镜技术（umExM）研究，将创新膜标记与优化的膨胀显微镜协议结合，实现组织中膜的密集标记和纳米级可视化，为神经科学和生物学研究提供新手段。
在生命科学领域，脂质膜对于生物系统的纳米级分区起着关键作用，就像细胞内的 “隐形边界”，精准界定着各种生理活动的范围。然而，想要在完整组织中，以纳米级精度对脂质膜进行荧光可视化，并且达到高标记密度，一直是困扰科研人员的难题。这就好比在错综复杂的迷宫中，想要清晰地标记出每一条细微的通道，却缺乏合适的工具。传统的光学显微镜受限于分辨率，难以捕捉到脂质膜的精细结构；而现有的一些膜标记和可视化方法，在固定组织中实现密集标记也困难重重。在这种情况下，为了突破脂质膜成像的困境，来自麻省理工学院（Massachusetts Institute of Technology）等机构的研究人员开展了一项重要研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员为解决脂质膜在完整组织中难以实现纳米级高标记密度荧光可视化的问题，开发了超微结构膜膨胀显微镜技术（ultrastructural membrane expansion microscopy，umExM）。该技术主要结合了创新的膜标记和优化的膨胀显微镜协议。在样本处理方面，研究人员对小鼠脑组织进行固定、切片等一系列操作；在成像分析上，运用多种成像技术和分析方法，来实现对膜结构的观察和研究。
研究设计
研究人员精心设计了一种非天然合成的两亲性膜标记探针。这个探针就像一把精心打造的 “分子钥匙”，具备多个独特的功能。它拥有类似传统荧光亲脂性染料的亲脂性，能够像 “导航仪” 一样，引导自身优先定位并在膜内扩散；同时带有化学手柄和聚合物可锚定手柄，前者能在膨胀显微镜（ExM）聚合物形成后选择性地连接荧光团，后者则能让探针成功融入 ExM 凝胶网络，从而实现物理膨胀。研究人员通过初步设计和最终优化两个阶段，不断改进探针性能。最终确定的 pGk13a 探针，在结合优化的 ExM 协议后，能有效实现对多种膜结构的标记。
技术验证
研究人员对 umExM 进行了全面的验证。通过对比预膨胀和后膨胀的图像，发现 umExM 的膨胀具有良好的各向同性，其分辨率可达～60nm，与先前报道的具有相似膨胀因子的 ExM 协议相当。在对小鼠脑组织切片的研究中，umExM 成功识别出轴突、运动纤毛等多种超微结构特征，并且所测量的轴突和纤毛直径与先前使用电子显微镜（EM）获得的数据相近，这充分证明了 umExM 在解析已知超微结构特征方面的有效性。
标记特性评估
umExM 在膜标记的均匀性和连续性方面表现出色。在对小鼠脑切片的 3D 体积成像分析中，umExM 标记的平均信号背景比（S/B）始终保持较高水平，在不同脑区和成像深度都能稳定地呈现出高对比度的膜结构。在对纤毛膜等单个膜结构的连续性分析中，发现 > 97% 的纤毛膜在以 60nm 为间隙测量长度的标准下是连续的。与其他商业可用的膜探针相比，umExM 的 S/B 比高出约 30 - 39 倍，且信号密度足以进行膜结构的追踪分析。
兼容性研究
umExM 与多种检测方法具有良好的兼容性。在与抗体染色的结合实验中，无论是预膨胀抗体染色还是后膨胀抗体染色，umExM 都能成功显示出蛋白质的定位信息，并且与膜标记信号相互印证，如在对突触囊泡蛋白 SV2A 和突触后密度蛋白 PSD95 的检测中，清晰地展示了蛋白质与膜结构的关联。umExM 还能与 RNA 荧光原位杂交（FISH）技术结合，通过添加 RNA 锚定步骤，成功实现了对 ACTB mRNA 的可视化，证明了其在同时可视化膜结构、蛋白质和 RNA 方面的能力。
神经元分析应用
umExM 在神经元研究中发挥了重要作用。它能够对神经元的不同组成部分，如细胞体、树突和轴突进行准确的分割。通过对 Thy1 - YFP 小鼠固定脑切片的研究，利用 umExM 图像进行手动分割，并与基于抗 GFP 信号的分割结果进行对比，发现 pGk13a 信号引导的分割具有很高的准确性，不同神经元结构的 Rand 评分均接近 1。umExM 还支持对轴突的追踪，在对有髓和无髓轴突的追踪实验中，基于 pGk13a 信号的追踪结果与基于抗 GFP 信号的追踪结果高度一致。对于像胼胝体这样轴突密集的脑区，通过改进的双凝胶化处理，umExM 也能清晰地显示神经元过程，实现对轴突的有效追踪。
提高分辨率探索
研究人员探索了提高 umExM 分辨率的方法。他们将 umExM 与基于自相关和两步反卷积的超分辨率成像（SACD）方法相结合，通过对固定小鼠脑切片的成像和数据分析，最终获得了～33nm 的有效分辨率。研究人员还开发了 umExM 的迭代形式，通过对固定脑切片进行多次处理和膨胀，实现了～12x 的膨胀，获得了～35nm 的有效分辨率，并且观察到了线粒体嵴等更精细的结构。
研究表明，umExM 成功实现了对膜的密集标记和高完整性的膨胀，能够在标准共聚焦显微镜下对膜结构进行成像，为神经科学和生物学研究提供了一种强大的工具。虽然 umExM 目前的分辨率还无法与高端电子显微镜相媲美，且探针可能存在与不同膜类型结合差异的问题，但它在多种应用场景中展现出了巨大的潜力。umExM 有望与其他 ExM 协议有效结合，如与 ExFISH 结合简化实验流程，与扩展测序（ExSeq）结合助力空间转录组学研究。未来，进一步优化 umExM 的迭代形式，有望实现基于标准共聚焦显微镜的神经元及其连接的精确追踪，为生命科学研究带来更多突破。
