非典型海马兴奋性神经元表达和支配客体记忆

锥体细胞被经典地认为包含了耻骨下的兴奋输出。在这里，作者展示了“卵形细胞”的存在，这是一种具有特殊基因表达、形态、投射和功能的兴奋性丘下神经元。

　　

新型海马兴奋性神经元：功能揭示与记忆调控新解

在大脑的奥秘探索之旅中，神经元的研究一直占据着重要地位。来自加拿大英属哥伦比亚大学（University of British Columbia）生命科学研究所细胞与生理科学系等多个单位的研究人员，在《Nature Communications》期刊上发表了一篇题为 “Atypical hippocampal excitatory neurons express and govern object memory” 的论文。这一研究成果意义重大，它为深入理解海马体在记忆形成和行为调控中的作用机制提供了全新视角，有助于揭示大脑记忆编码和检索的细胞层面机制，为未来治疗记忆相关疾病奠定了理论基础。

研究背景

海马体在空间导航和记忆方面发挥着关键作用，一直是神经科学研究的重点区域。传统观点认为，海马体中的锥体细胞能灵活表征空间和非空间信息。然而，近年来的研究表明，海马体中存在多种不同类型的兴奋性神经元，这意味着海马体的表征和功能可能受这些神经元类型的约束和影响。因此，探究离散的兴奋性神经元亚型是否具有特定的特征选择性和表征特性，以及它们对行为的贡献，成为了海马体研究的关键问题。

在以往研究中，对于海马体中神经元功能的理解多聚焦于锥体细胞，但随着研究的深入，发现锥体细胞存在多种转录组离散亚型，其功能的灵活性和贡献可能受到这些亚型的限制。此外，关于海马体对空间和非空间信息的表征方式，究竟是通过一个空间调整的网络补充非空间信息，还是存在可分离的空间和非空间信息流，仍存在争议。这些未解决的问题促使研究人员进一步探索海马体中不同神经元亚型的功能特性。

研究材料和方法

1. 实验动物：实验选用成年（至少 6 周龄）的雌雄小鼠，在 12 小时光照 - 黑暗循环的环境中饲养，自由获取食物和水。所有涉及小鼠的实验程序均获得了英属哥伦比亚大学动物护理委员会和 Janelia 研究园区机构动物护理和使用委员会的批准。

2. 分析方法：研究人员分析了已发表的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据，通过一系列数据处理和分析流程，利用 R 语言中的 Seurat v4 和自定义脚本，去除非神经元细胞和中间神经元，对数据进行归一化、特征选择、降维、聚类等操作，以识别出特殊的神经元亚型。

3. 验证方法：运用原位杂交技术，包括显色原位杂交和荧光原位杂交（FISH），对标记基因的表达进行检测，以验证 scRNA-seq 结果，并分析细胞的表型和空间分布。

4. 小鼠模型构建：构建 Ly6g6e-IRES-Cre 小鼠品系，利用重组技术将 IRES-Cre-frt-PGKNeoR-frt 插入 Ly6g6e 基因的终止密码子后，通过 CRISPR/Cas9 系统辅助 ES 细胞靶向筛选，最终获得稳定的小鼠品系。

5. 神经元追踪：采用病毒示踪技术，包括顺行追踪和逆行追踪，结合光片显微镜成像和组织清除技术，研究卵圆神经元的投射模式和形态学特征。

6. 电生理记录：制备脑片进行全细胞膜片钳记录，研究卵圆神经元和锥体细胞的电生理特性，包括输入电阻、 rheobase、放电频率等。

7. 钙成像技术：通过手术在小鼠脑部植入微型显微镜和 GRIN 镜头，利用钙成像技术观察神经元在行为过程中的活动变化，分析神经元对不同刺激的反应。

8. 行为学实验：开展新颖物体识别和新颖物体位置识别等行为学实验，评估小鼠的记忆能力，并结合光遗传学技术，在行为过程中对特定神经元进行抑制或激活操作，观察其对行为的影响。

研究技术路线

1. 基于已有的单细胞 RNA 测序数据，利用生物信息学方法筛选出可能的特殊神经元亚型，确定卵圆神经元的基因表达特征。

2. 通过原位杂交实验，从基因表达层面验证卵圆神经元的存在，并明确其在海马体中的空间定位。

3. 构建 Ly6g6e-IRES-Cre 小鼠品系，结合病毒示踪技术，研究卵圆神经元的投射靶点和形态学特征，包括轴突和树突的结构。

4. 运用电生理记录和钙成像技术，分别在离体和在体条件下，分析卵圆神经元的电生理特性和对不同刺激的反应特性。

5. 开展行为学实验，结合光遗传学技术，探究卵圆神经元在物体记忆和行为偏好中的作用机制。

研究结果

1. 海马体中异常神经元亚型的识别与空间定位

研究人员通过对 1949 个单细胞转录组的分析，利用数据驱动的方法，从海马体中识别出一种稀疏且明显偏离其他神经元的亚型。该亚型表达神经元标记 Snap25、兴奋性神经元标记 Slc17a7、Slc17a6 和 Camk2a，缺乏抑制性神经元标记 Gad1，且有 508 个基因差异表达。通过对更大规模数据集的分析以及原位杂交实验，进一步证实了 Ly6g6e 在该亚型中的特异性表达，且其表达细胞位于海马体最深层，与 Cck 表达细胞的空间分布不同。

2. 深层神经元具有非典型非锥体细胞体

FISH 和 Nissl 染色结果显示，Ly6g6e 表达神经元的细胞体较小，呈切向排列。对细胞体几何形状的分析表明，Ly6g6e 表达细胞体的总体面积显著减小，且其长轴沿肺泡轴方向伸长，与 Cck 表达神经元在细胞体形态上存在明显差异。基于多种细胞体特征的主成分分析结果显示，Ly6g6e 表达细胞体和 Cck 表达细胞体可根据其体细胞几何形状进行区分，研究人员将 Ly6g6e 表达细胞命名为非锥体细胞 “卵圆神经元”。

3. 卵圆神经元选择性地投射到前丘脑

研究人员构建了 Ly6g6e-IRES-Cre 小鼠品系，并利用 Cre 依赖的病毒示踪技术，发现卵圆神经元主要投射到前丘脑的前腹侧和前内侧核（ATN）。通过逆行追踪结合 mFISH 以及对单细胞轴突投射数据的分析，进一步验证了卵圆神经元对 ATN 的特异性投射，且这种投射模式与锥体细胞明显不同。

4. 卵圆神经元具有特殊的树突结构

研究发现，卵圆神经元通常缺乏经典锥体细胞的径向斜树突，通过对单细胞树突特性的分析，发现 ATN 投射的卵圆神经元分支较少，总分支长度较短，与投射到伏隔核的锥体细胞在树突形态上存在显著差异。

5. 卵圆神经元相对于锥体细胞具有更高的兴奋性

全细胞膜片钳记录结果显示，几乎所有记录到的卵圆神经元都表现出规则的放电特性，而锥体细胞则表现出规则放电和爆发式放电的混合模式。卵圆神经元的输入电阻明显高于锥体细胞，且在兴奋性相关的电生理特性上存在显著差异，包括更低的 rheobase 和更陡峭的输入 - 输出曲线。计算模型表明，卵圆神经元缺乏径向斜树突是其输入电阻升高的原因之一。

6. 卵圆神经元对新奇物体的慢反应特性

通过钙成像实验，研究人员发现卵圆神经元在体内具有缓慢、自发且同步的活动，对新奇物体有持续的群体活动反应，而对熟悉物体则缺乏类似反应。在物体识别实验中，大多数卵圆神经元在行为过程中对新奇物体有反应，且这种记忆表达可持续数月，而锥体细胞对新奇或熟悉物体的反应较少。此外，卵圆神经元对新奇物体的反应具有选择性，对熟悉物体在新奇位置或环境变化不产生明显反应。

7. 抑制卵圆神经元会阻碍物体记忆编码

利用基于 ArchT 的光遗传学抑制技术，研究人员发现抑制卵圆神经元会导致物体记忆编码显著受损，在后续的检索过程中，小鼠对新奇物体和熟悉物体的辨别能力下降至随机水平；而在检索阶段抑制卵圆神经元，对辨别能力的影响相对较小。这表明卵圆神经元在物体记忆编码中起着不可或缺的作用，且其功能与锥体细胞不同，抑制锥体细胞会影响空间学习，而抑制卵圆神经元对空间学习无明显影响。

8. 激活卵圆神经元会引发熟悉物体寻求行为

使用基于 ChR2 的光遗传学激活技术，研究发现激活卵圆神经元在编码阶段对小鼠的新奇物体学习无显著影响，但在短期和长期检索阶段，会导致小鼠对熟悉物体产生偏好。这种熟悉物体寻求行为具有选择性，在空间位置任务中激活卵圆神经元不会产生类似偏好，且与锥体细胞的反应不同，激活锥体细胞不会改变其对新奇物体的偏好。

研究结论与讨论

研究人员成功识别出一种新型的海马体兴奋性神经元 —— 卵圆神经元，它在基因表达、电生理、形态和连接性等方面与经典锥体细胞存在显著差异。卵圆神经元对新奇物体有特异性反应，在物体记忆编码和检索过程中发挥着关键作用，且其功能与锥体细胞存在明显的双分离现象。这一发现揭示了海马体中存在细胞类型特异性的功能分工，丰富了人们对海马体功能的理解。

从功能机制上看，卵圆神经元可能作为一种新奇性相关的 “门控”，在物体新奇性激活下，允许下游记忆网络访问和更新物体特定信息。其对新奇物体的反应可能源于内嗅皮层的瞬时感觉输入与内侧隔核乙酰胆碱信号的结合，且这种反应可能通过增强前丘脑的突触长期增强作用，促进物体记忆的巩固。

与以往研究相比，该研究不仅证实了先前关于海马体结构和功能的部分发现，还将一些结果归因于卵圆神经元这一特殊细胞类型，并明确了其与经典锥体细胞在记忆贡献上的差异。研究还发现，卵圆神经元可能存在于人类海马体中，其所在的多形层在不同物种中结构保守，这表明卵圆神经元可能在认知过程中具有广泛而重要的作用。

总体而言，该研究为理解海马体的功能和记忆机制提供了新的细胞和分子层面的证据，拓展了人们对大脑记忆编码和检索机制的认识，对未来神经科学领域研究记忆相关疾病的发病机制和治疗策略具有重要的指导意义。