共翻译蛋白聚集和核糖体延迟作为广谱抗菌机制

蛋白质生物合成是现有抗生素抑制细菌核糖体的效率或保真度的主要目标。在这里，作者表明，合成肽通过不同的机制显示杀菌活性，诱导新生肽链的共翻译聚集。

　　

新型抗菌机制：共翻译蛋白聚集与核糖体停滞的研究进展

在全球细菌耐药性问题日益严峻的当下，来自比利时鲁汶大学（KU Leuven）VIB 脑与疾病研究中心 Switch 实验室等多个单位的研究人员，在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Co-translational protein aggregation and ribosome stalling as a broad-spectrum antibacterial mechanism” 的论文。这一研究为开发新型抗菌药物开辟了新的路径，对解决耐药菌感染的难题具有重要意义。

研究背景

耐药菌已成为全球健康的重大威胁。像大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等常见病原菌，凭借多种耐药机制躲避传统抗生素的攻击。据统计，2019 年约 357 万人的死亡与抗生素耐药相关 。“ESKAPEE” 病原菌更是耐药菌中的代表，包括除肺炎链球菌外的上述多种耐药菌，还涵盖肠杆菌属和粪肠球菌等，开发针对它们的新型抗生素迫在眉睫。

抗菌肽（AMPs）作为潜在的抗菌药物备受关注。它是许多物种先天免疫系统的重要组成部分，具有快速杀菌的特性。其作用机制起初被认为主要是破坏细菌细胞膜，如今发现它还能与细胞内靶点相互作用。部分 AMPs 可形成淀粉样结构，但其抗菌活性的重要性尚不明确。

研究团队此前设计的抗菌肽可诱导靶蛋白聚集，使蛋白失去功能，且这种靶向基于蛋白序列中的聚集倾向区域（APRs）。APRs 通常位于球蛋白的疏水核心或跨膜蛋白的跨膜区域，突变率低。例如，针对 β - 内酰胺酶设计的肽在 β - 内酰胺抗生素存在时展现出条件毒性。基于此，研究人员推测寻找细菌蛋白质组中多个蛋白共有的 APRs，可能开发出广谱抗菌肽。

研究材料与方法

材料

研究选用了多种参考细菌菌株，如大肠杆菌（ATCC 25922 等）、肺炎克雷伯菌（ATCC 13883 等）、鲍曼不动杆菌（ATCC 19606 等），这些菌株购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。多药耐药菌则来自鲁汶大学医院。实验使用的肽 P33 由 Genscript 订购或自行合成，纯度大于 90%，且 N 端乙酰化、C 端酰胺化。实验还用到多种抗体，如 GFP 抗体（Cell Signaling Technology，2555S）、抗 HA 标签兔多克隆抗体（Covance，PRB - 101P）等，以及多种抗生素，如氨苄青霉素、粘菌素、替加环素等。

方法

1. 生物信息学分析：从 UniProt 获取细菌菌株的蛋白质序列，运用 TANGO 软件识别 APRs，设定分数阈值为 5 分 / 残基，同时设置温度 298K、pH 7.5、离子强度 0.05M。使用 R 语言中的 clusterProfiler v4.12.6 包进行基因本体富集分析，利用 Peptides v2.4.6 包计算细菌蛋白质的等电点和净电荷，借助 xssp - 3.0.10 软件中的 DSSP + 8.49 在相应 AlphaFold 蛋白质结构上计算二级结构倾向。

2. 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定：依据 EUCAST 指南，采用肉汤微量稀释法测定 MIC，在 96 孔聚苯乙烯平底微量滴定板中进行实验。将单个细菌菌落接种于 MH 肉汤培养基，37°C 培养过夜，稀释菌液至 10?细胞 /mL。肽用 6M 尿素溶解后进行实验，每个孔加入不同浓度肽的 MH 肉汤培养基 50μL，再加入 50μL 稀释菌液。以最大浓度载体存在时细菌的生长为阳性对照，培养基中细菌生长为阴性对照，37°C 孵育过夜，通过 OD???测定细菌生长情况。MBC 则通过 CFU 计数法确定，即能杀死 99% 细菌的肽的最低浓度。

3. 细菌培养与处理：将参考细菌菌株和临床分离菌株的菌落接种于 Mueller - Hinton（MH）琼脂平板，37°C 过夜培养，再接种到 5mL 新鲜 MHB 培养基中继续培养。

4. 细胞毒性和溶血活性测定：采用 Cell Titer Blue 法测定 P33 对 HeLa 细胞、SH - SY5Y 细胞等多种哺乳动物细胞的细胞毒性。将细胞接种于 96 孔圆底板，加入不同浓度的肽，以 1% Triton X - 100 处理的细胞为阳性对照，载体处理的细胞为阴性对照，37°C、5% CO?、90% 湿度条件下孵育 4 小时，离心后取上清测定 490nm 处吸光度，计算细胞活力。通过测量人红细胞溶血情况测定肽的溶血活性，将红细胞与系列稀释的肽混合，37°C 孵育 1 小时，离心后测定上清在 405nm 处吸光度，以 1% Triton 处理的红细胞为 100% 溶血对照，最大使用浓度的载体为 0% 溶血对照。

5. 其他实验方法：运用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜 - 红外光谱（AFM - IR）、石英晶体微天平（QCM - D）等技术对细菌细胞、蛋白质聚集物、肽 - 脂质相互作用等进行分析。采用 RNA 测序（RNA - seq）分析包涵体中的 RNA，通过构建报告菌株和进行蛋白质组学分析探究蛋白质聚集机制。利用体内动物实验，如小鼠尿路感染模型和败血症模型，评估肽的体内抗菌效果。

研究结果

P33 的作用机制依赖蛋白质聚集

研究人员首先使用超分辨率结构光照明显微镜（SIM）对经 P33 处理的大肠杆菌 ATCC 25922 细胞进行观察，用五聚体甲酰噻吩乙酸（pFTAA）染色后，发现细胞出现典型的极性包涵体（IBs），而氨苄青霉素和粘菌素处理的细胞未出现，证实 P33 处理可引发细胞内聚集。AFM - IR 分析显示包涵体区域蛋白质浓度高且富含 β - 折叠，进一步证明其具有淀粉样性质。SEM 和 TEM 观察表明 P33 处理的细胞细胞膜无明显损伤，QCM - D 实验显示 P33 在测试浓度下与脂质双层结合不显著，表明其主要作用于细胞内靶点。

使用荧光标记的 P33（FITC - P33）进行 SIM 荧光显微镜观察，发现细胞内 IBs 中含有该肽，且肽未在细胞膜大量积累。通过荧光激活细胞分选（FACS）分析，发现肽的摄取先于细胞膜对 Sytox Blue 染料的通透性增加（指示细胞死亡），且聚集和细胞通透性增加在肽摄取后以相似速率发生，说明 P33 的作用起始于细胞内。

P33 具有广谱抗菌活性

通过分析 P33 的 APR 在大肠杆菌蛋白质组中同源序列匹配的 BLOSUM80 分数分布，并与随机肽对比，发现 P33 的 APR 有更多高相似性匹配。在其他 ESKAPE 病原菌蛋白质组中也观察到类似现象，这表明 P33 可能对 ESKAPE 病原菌具有广谱活性。

使用微量稀释法对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性多药耐药菌进行抗菌活性测试，结果显示 P33 对大多数测试菌株表现出强大的广谱抗菌活性，MIC 和 MBC 浓度相近，表明其具有杀菌作用。对 132 株临床分离菌的测试发现，除 MRSA 表现出相对耐药外，其他物种均有敏感和耐药克隆，这意味着 P33 的多靶点作用模式可防止因靶点突变产生耐药性，但仍可能因水平基因转移获得耐药基因（如外排泵或蛋白酶相关基因）而产生耐药。

研究还发现 P33 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在生物膜状态下也有活性，接近 MIC 浓度的 P33 可显著减少生物膜形成。对多种细菌菌株用 P33 处理后染色观察，发现均出现极性包涵体，且 P33 杀菌速率与聚集阳性细胞比例相关，表明其基于聚集的作用模式在多种细菌中保守。

P33 诱导多种细菌蛋白质聚集

对经 P33 处理的多种菌株进行 IBs 提取和 SDS - PAGE 分析，发现不同大小的细菌蛋白质存在于 IBs 组分中，而未处理细胞中则没有。对大肠杆菌（ATCC 25922）进行基于质谱（MS）的蛋白质组学分析，检测到 1188 种蛋白质在可溶性和 IBs 组分中，且 IBs 组分中蛋白质丰度随时间增加，表明 P33 有效诱导蛋白质聚集。

基因本体富集分析显示，IBs 组分中显著富集外膜蛋白和参与蛋白质翻译的蛋白，如核糖体成分。在大肠杆菌蛋白质组中，有 34 种蛋白质与 P33 的 APR 具有高局部同源性，但 MS 仅检测到其中 5 种，3 种在 IBs 中富集，且这 3 种蛋白的 β - 折叠含量最高。对 IBs 组成随时间变化的分析发现，核糖体和外膜蛋白在 IBs 形成过程中比例未增加，而核糖体救援因子 SmpB 和 Hpf 等在比例增加的蛋白中被鉴定出来，表明 P33 诱导的聚集可能非常迅速，且细胞对 IBs 形成存在响应，会招募调节蛋白。

RNA 测序表明核糖体停滞和新生链介导的聚集

对处理后的细菌用 SYTO RNASelect Green Fluorescent Cell Stain 染色，发现包涵体中有 RNA 积累。对包涵体组分进行 RNA 提取和毛细管电泳，检测到 30S 和 50S 核糖体 RNA 及短片段 mRNA。RNA 测序检测到 4052 种 mRNA，MS 检测到的 IBs 组分中的蛋白质 94.9% 在 RNA - seq 数据中也有发现。虽然 MS 检测的蛋白质丰度与 RNA - seq 检测的 mRNA 丰度相关性较弱，但高丰度蛋白质对应的 mRNA 表达也较高，表明翻译中的核糖体（含 mRNA 和蛋白质）可能被困在包涵体中。

用红霉素抑制核糖体翻译，可挽救在致死剂量 P33 作用下大肠杆菌的活力，且 pFTAA 染色减少，表明 P33 的抗菌作用依赖于活跃的蛋白质翻译。在体外翻译系统中，P33 不影响 GFP 的产生，说明其对核糖体无直接作用，且不作用于 GFP 转录本。

MS 蛋白质组学数据显示 P33 处理后 SmpB 被招募到 IBs，RNA 测序数据表明转移 - 信使 RNA（tmRNA，即 SsrA）是 IBs 组分中含量丰富的 RNA 之一。SmpB - tmRNA/SsrA 复合物是细菌主要的核糖体救援系统，同时在 IBs 中还检测到识别和降解 SsrA 标记新生链的蛋白酶。使用 CRISPR 技术构建报告菌株，经 P33 处理后，通过 Western blot 分析发现 HA 标记的多肽大量积累且富集在 IBs 中，表明核糖体救援机制被激活，新生链在共翻译过程中被标记，IBs 可能含有停滞的核糖体、新生链和相关 mRNA。此外，研究还构建了人工构建体，结果表明共翻译过程中新生链暴露 APR 会导致核糖体停滞和包涵体形成。

体内疗效评估

对 P33 进行体内实验前，先评估其对原代人红细胞和人细胞系的潜在毒性，结果显示无明显毒性。在 C57BL/6Jax 小鼠的剂量递增测试中，发现静脉注射 P33 在 1mg/kg 剂量时出现耐受性问题，但 FITC - P33 有缓解作用。

在小鼠尿路感染模型中，用大肠杆菌 ATCC 25922 感染雌性小鼠尿道，1 小时后静脉注射 10mg/kg 的 FITC - P33，结果显示尿路器官中的细菌载量降低 2 - 3 个对数级。在败血症小鼠模型中，用鲍曼不动杆菌 ATCC 19606 感染小鼠，分别在感染后 1 小时和 3 小时皮下注射 FITC - P33（10mg/kg）、载体或替加环素（30mg/kg），24 小时后检测血液中细菌载量，发现 FITC - P33 使细菌载量降低 1 个对数级，虽效果不如替加环素，但表明 FITC - P33 在体内不同小鼠模型中均有抗菌效果，但仍需进一步开发优化。

研究结论与讨论

研究表明，P33 这种基于 APR 设计的抗菌肽，能破坏细菌共翻译蛋白质折叠，引发广泛的蛋白质聚集，尤其是外膜蛋白，最终导致蛋白质稳态崩溃。它对多种革兰氏阴性病原菌，包括耐药菌株，在浮游生长和生物膜状态下均有抗菌活性。其作用机制是通过诱导新生链聚集，导致核糖体停滞，激活核糖体救援机制，但救援机制未能解决毒性问题。

虽然 P33 的初始肽相互作用特异性尚不完全明确，可能是与具有同源 APR 的新生链结合引发蛋白质稳态破坏，也可能基于一般参数结合，还不能完全排除与核糖体或核糖体救援途径直接相互作用的可能性。但无论聚集触发机制如何，核糖体蛋白本身易聚集，游离核糖体蛋白具有细胞毒性，这些因素都可能有助于 P33 的抗菌效果。

这项研究为开发新型抗菌疗法开辟了新途径，P33 独特的作用模式、广谱抗菌活性和有前景的体内疗效，凸显了这种策略在应对耐药菌感染挑战中的潜力。然而，要将这些发现转化为临床可用的抗菌药物，还需要进一步研究和优化，如提高肽的稳定性、降低毒性、增强抗菌效果等，以解决目前存在的问题，为临床治疗耐药菌感染提供有效的解决方案。