探究 Tecovirimat 抗痘苗病毒活性及病毒耐药机制的重要进展

特可维林可使痘病毒磷脂酶F13二聚化，阻断病毒传播。抗替柯病毒的临床猴痘病毒株在F13二聚体界面显示突变。

　　

探究 Tecovirimat 抗痘苗病毒活性及病毒耐药机制的重要进展

近期，来自法国巴斯德研究所（Institut Pasteur）、巴黎西岱大学（Université Paris Cité）的结构生物学与传染病研究团队（Structural Biology of Infectious Diseases）的 Riccardo Vernuccio 等人，在《Nature Microbiology》期刊发表了题为 “Structural insights into tecovirimat antiviral activity and poxvirus resistance” 的论文。该研究通过解析病毒磷脂酶 F13 与 Tecovirimat 结合的结构，揭示了 Tecovirimat 的抗病毒机制及痘苗病毒的耐药机制，为监测耐药菌株、开发新型抗病毒药物奠定了重要基础。

一、研究背景

痘苗病毒（Orthopoxviruses，OPXVs）可引发多种人类疾病，如天花（由天花病毒 Variola virus，VARV 引起）和猴痘（由猴痘病毒 Monkeypox virus，MPXV 引起），此外，牛痘（Cowpox，CPXV）、骆驼痘（Camelpox，CMLP）和北极痘（Borealpox，BRPV）也会导致散发性人畜共患感染。50 年前天花疫苗接种停止，使得当前大部分人群缺乏对痘苗病毒的免疫力，人们担忧人畜共患痘苗病毒的出现或天花病毒的重新引入。2022 年以来，猴痘病毒引发了两次大规模流行，第一代疫苗不符合现代安全标准，第三代减毒疫苗虽有效，但大规模生产困难且无法诱导长期免疫，目前基于 mRNA 的候选疫苗在动物模型中显示出疗效，正在进行临床试验。

OPXVs 的复制周期独特，会产生成熟病毒和包膜病毒两种不同的病毒粒子。成熟病毒在细胞质中产生，由病毒衣壳和单层膜包裹，为在宿主体内传播，成熟病毒会形成包裹有三层膜的包裹病毒，最外层膜与质膜融合后，以包膜病毒形式离开宿主细胞。目前有两种口服药物被批准用于治疗天花和猴痘，其中 Brincidofovir 是病毒 DNA 聚合酶抑制剂，但会产生副作用；Tecovirimat 是成熟病毒包裹过程的抑制剂，广泛用于治疗感染 IIb 分支菌株的猴痘患者，然而其耐药屏障低，已有多种耐药菌株被报道。研究表明 Tecovirimat 作用于病毒包膜蛋白 F13（一种膜锚定磷脂酶，在包裹病毒产生中起关键作用），但 Tecovirimat 的结合机制及耐药突变体逃逸药物作用的机制尚不明确，相关结构和机制数据的缺乏阻碍了对耐药突变的预测和更好药物的开发。

二、研究材料与方法

（一）蛋白质制备与纯化

将针对大肠杆菌表达进行密码子优化的合成基因克隆到 pET - 28a (+) 载体中，去除疏水 N 端尾巴并引入突变以去除棕榈酰化位点和周围疏水残基，转化大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞诱导表达，经亲和层析、还原处理和尺寸排阻色谱纯化，获得可溶性 F13（sF13）野生型及突变体蛋白。

（二）结晶与结构测定

对纯化后的蛋白去除标签，进行结晶筛选，通过气相扩散法获得晶体。用含有 Tecovirimat 或 IMCBH 的溶液浸泡晶体，收集 X 射线衍射数据，利用分子置换法确定相位，迭代构建和优化结构模型，使用多种软件进行数据处理和模型验证。

（三）分子动力学模拟

对 sF13 二聚体进行结构修饰，包括建模未解析的 N 端残基、添加棕榈酰化修饰和中和末端电荷，将其置于模拟高尔基体膜脂质组成的膜上，选择合适的力场，进行能量最小化和多步平衡，最后进行生产运行模拟，分析单体 - 单体接触等。

（四）其他实验方法

运用分析超速离心（AUC）、尺寸排阻色谱 - 小角 X 射线散射（SEC - SAXS）、质谱光度法、邻近连接测定（PLA）和绝对结合自由能（ABFE）计算等方法，研究 Tecovirimat 与 F13 的相互作用、诱导二聚化的能力及耐药突变体的影响等；通过病毒空斑试验和序列分析评估病毒对药物的敏感性和潜在耐药突变。

三、研究结果

（一）Tecovirimat 结合于两个原体之间的口袋

通过结晶获得两种 sF13 晶体形式，均为同源二聚体，由两个螺旋和一个 β - 发夹稳定，二聚体界面形成大腔。分子动力学模拟显示该二聚体在模拟高尔基体膜上稳定，且与其他具有生理作用的磷脂酶相似，单逃逸突变体映射表明 F13 在膜上二聚化且被 Tecovirimat 和 IMCBH 靶向。通过晶体浸泡实验和计算确定 Tecovirimat 结合位点，其结合口袋位于二聚体界面，多种计算和实验表明 Tecovirimat 与 IMCBH 结合于同一口袋，且 Tecovirimat 像分子胶水一样稳定 F13 同源二聚体。

（二）Tecovirimat 稳定 F13 同源二聚体

AUC 实验表明，无 Tecovirimat 时 sF13 主要为单体，有药物时平衡向二聚体形式转移；SEC - SAXS 分析证实溶液中 Tecovirimat 诱导的二聚体与晶体中的二聚体结构一致。质谱光度法计算出 Tecovirimat 诱导 sF13 二聚化的 EC50 为 92 nM，IMCBH 为 1475 nM，且溶液中活性与抗病毒活性相关。结合亲和力计算表明 Tecovirimat 在二聚化 EC50 浓度下结合并稳定瞬时二聚体。

（三）Tecovirimat 逃逸突变体阻止 F13 二聚化

利用质谱光度法检测发现，临床分离的 MPXV 菌株中的逃逸突变体 A295E、4MUT 和 ΔN267 在 Tecovirimat 存在时不形成同源二聚体，而 G277C 可形成。AUC 实验在更高蛋白浓度下，观察到 A295E 部分二聚化，4MUT 不发生二聚化。对 A295E 突变体晶体结构分析发现，其在无 Tecovirimat 时二聚体稳定性降低，有药物时恢复天然构象；4MUT 可能因 α10 螺旋中引入脯氨酸阻止二聚化。PLA 实验表明 Tecovirimat 在细胞中诱导 F13 二聚化，逃逸突变体干扰这一过程。

（四）二聚体稳定突变使 VACV 失去活力

设计在 Tecovirimat 结合腔引入大侧链的突变体 S292F、S292K 和 L296Y，质谱光度法显示它们对 Tecovirimat 完全不敏感，部分突变体在无药物时形成二聚体。将 S292F 引入 VACV 后无法生成重组病毒，表明该突变对病毒形态发生有害。

（五）鉴定先前未描述的潜在 Tecovirimat 逃逸突变体

通过对 GISAID 和 GenBank 数据库中病毒序列分析，在 MPXV II 分支序列中鉴定出 L296F、D280Y 和 P243A 三个潜在逃逸突变体，在 VARV 菌株中鉴定出 R291E。对 rVACV R291E 的研究表明，该突变体对 Tecovirimat 仍敏感，但结构分析显示其可能因静电排斥阻碍二聚体形成从而潜在赋予耐药性。

四、研究结论与讨论

该研究通过晶体学和分子动力学模拟等手段，揭示了 F13 与 Tecovirimat 的相互作用结构，发现 F13 可能在膜上同源二聚化，Tecovirimat 作为分子胶水插入两个原体间的腔，诱导 F13 二聚化，而逃逸突变体通过改变 F13 二聚化区域阻止药物诱导的二聚化。这些发现为理解 Tecovirimat 的抗病毒机制和痘苗病毒的耐药机制提供了分子框架。

研究结果对公共卫生具有重要意义。精确绘制 F13/Tecovirimat 接触位点，为基于序列评估临床分离株对 Tecovirimat 的敏感性提供了可能，有助于监测疫情。目前 Tecovirimat 对 MPXV I 分支菌株的疗效存在争议，本研究虽未发现 I 分支菌株中可解释疗效缺乏的突变，但为后续研究提供了基础。此外，该研究为开发针对 Tecovirimat 耐药菌株的新型抗病毒药物开辟了道路，其结构数据、模拟结果和实验方法将推动相关药物研发工作。