驱动药物成瘾的分子因素

　　

俄勒冈健康与科学大学（Oregon Health & Science University）的研究人员在《Neuropsychopharmacology》期刊上发表了题为 “Absence of TAAR1 function increases methamphetamine-induced excitability of dorsal raphe serotonin neurons and drives binge-level methamphetamine intake” 的论文。该论文在甲基苯丙胺（Methamphetamine，MA）成瘾研究领域具有重要意义，为深入理解 MA 使用障碍的发病机制和开发新的治疗方法提供了关键线索。

研究背景

在过去十年间，MA 使用障碍的发生率急剧上升，但目前仍缺乏有效的治疗手段。探究 MA 影响大脑中与奖赏和厌恶处理相关区域神经传递的机制，对于理解成瘾的细胞机制和开发治疗 MA 使用障碍的疗法至关重要。

研究人员利用小鼠作为研究对象，通过选择性育种培育出了对 MA 自愿摄入量不同的品系，即 MA 高饮（MA high drinking，MAHDR）和 MA 低饮（MA low drinking，MALDR）品系。MAHDR 小鼠对 MA 的奖赏效应高度敏感，而 MALDR 小鼠则表现出不敏感。全基因组定位发现，小鼠 10 号染色体上的一个位点解释了 MADR 品系间 MA 摄入量 60% 的遗传变异，该位点追溯到痕量胺相关受体 1（trace amine - associated receptor 1，TAAR1）基因编码序列中的一个单核苷酸多态性。MA 是 TAAR1 的激动剂，MAHDR 小鼠的 Taar1 基因发生自发突变（Taar1m1J），编码无功能的 TAAR1；而 MALDR 小鼠至少拥有一个编码功能性 TAAR1 的参考 Taar1 + 等位基因。此前研究已证实 TAAR1 功能在 MA 摄入和对 MA 效应的敏感性中起关键作用，但 TAAR1 功能是否影响 MA 诱导的背侧缝核 5 - 羟色胺（serotonin，5 - HT）神经元活动以及其与 MA 摄入量之间的关系尚不清楚。背侧缝核 5 - HT 神经元参与奖赏刺激的感知，且 TAAR1 在该区域广泛表达，因此研究人员推测 TAAR1 功能可能通过调节背侧缝核 5 - HT 神经元活动影响 MA 摄入。

研究方法

1. 动物实验：实验小鼠均在波特兰退伍军人事务医疗中心（VA Portland Health Care System）的兽医医疗单位出生。断奶后，小鼠被饲养在标准的丙烯酸塑料鞋盒式笼子中，置于气候控制的房间内，保持 12 小时光照、12 小时黑暗的循环，自由获取水和啮齿动物饲料。实验使用 28 - 45 日龄的 MA 未处理的雄性和雌性 MAHDR、MALDR 小鼠进行电生理研究，82 - 85 日龄的雄性和雌性 MAHDR - Taar1+/+ 敲入（knock - in，KI）和 MAHDR - Taar1m1J/m1J 小鼠进行 MA 浓度递增的两瓶选择实验，29 - 43 日龄的此类小鼠用于电生理研究。

2. 基因编辑：利用 CRISPR - Cas9 技术，在俄勒冈健康与科学大学的转基因小鼠模型共享资源核心创建 MAHDR - Taar1+/+ KI 小鼠，即将 Taar1m1J 等位基因替换为 Taar1 + 参考等位基因，以研究功能性 TAAR1 对 MA 摄入和神经元活动的影响。

3. 药物处理：实验中使用的（+）MA 盐酸盐、D - APV、bicuculline、fluoxetine、SB 216641、WAY 100635、血清素盐酸盐等药物，除 MA 用于饮用时溶解在自来水中外，其余均溶解在双蒸水中。

4. 两瓶选择饮水实验：测量小鼠在 20 - 140mg/L 浓度范围内自愿饮用 MA 的情况，浓度每 4 天以 20mg/L 的增量递增。实验期间，小鼠单独饲养，适应新饮水瓶后，在黑暗周期开始前 3 小时添加含 MA 的瓶子，在光照阶段开始 3 小时后移除。记录 18 小时（水与 MA）和 6 小时（仅水）的液体消耗量，每 2 天收集体重数据，计算每日每千克体重消耗的 MA 毫克数。

5. 脑片制备和电生理记录：将小鼠深度麻醉后取脑，将脑浸入冰冷的蔗糖人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，aCSF）中，制作包含背侧缝核的冠状切片，切片厚度为 230 - 250μm。将切片置于含氧 aCSF 中平衡，然后转移到记录室进行电生理记录。使用玻璃电极在电流钳模式下进行全细胞记录，记录神经元的静息膜电位（resting membrane potential，RMP）和放电频率，通过给予不同强度的去极化电流刺激来评估神经元的放电模式。通过对浴缸应用血清素盐酸盐（10μM）产生可逆抑制反应来初步选择假定的血清素能背侧缝核神经元，电容超过 50pF 的神经元被确认为血清素能神经元并用于后续研究。

6. 数据分析：使用 Statistica 13.3 软件对数据进行分析。放电频率数据以平均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，通过重复测量方差分析（repeated measures ANOVA）评估差异，必要时使用 Tukey HSD 进行事后检验；RMP 的差异通过配对 t 检验或非配对 t 检验进行评估；MA 和总液体消耗量的差异通过重复测量方差分析，并在适当的时候进行组内或组间均值对比。显著性水平设定为≤0.05。

研究结果

1. MA 对 MALDR 背侧缝核 5 - HT 神经元的影响：对 MALDR 小鼠脑片的研究发现，MA 灌流显著降低了背侧缝核 5 - HT 神经元的平均放电频率，同时使神经元的 RMP 显著超极化。这表明在具有功能性 TAAR1 的 MALDR 小鼠中，MA 能够抑制背侧缝核 5 - HT 神经元的活动。而在 MAHDR 小鼠中，MA 灌流对背侧缝核 5 - HT 神经元的平均放电频率和 RMP 均无显著影响。

2. 5 - HT 自身受体拮抗剂存在时 MA 对神经元活动的影响：在 5 - HT1A 和 5 - HT1B 自身受体拮抗剂存在的情况下，MA 显著增加了 MAHDR 小鼠背侧缝核 5 - HT 神经元的整体放电频率，使神经元的 RMP 去极化。然而，在 MALDR 小鼠中，MA 在 5 - HT 自身受体拮抗剂存在时对神经元的放电频率和 RMP 均无显著影响。这说明 MA 在 MALDR 小鼠中诱导的神经元放电减少和超极化是由于 5 - HT 自身受体的激活，而在 MAHDR 小鼠中，缺乏功能性 TAAR1 使得 MA 能够在 5 - HT 自身受体拮抗剂存在时增强神经元的活动。

3. TAAR1 功能对 MA 摄入的影响：通过对比 MAHDR - Taar1m1J/m1J 和 MAHDR - Taar1+/+ KI 小鼠在 MA 浓度递增的两瓶选择实验中的表现，发现 MAHDR - Taar1m1J/m1J 小鼠在所有浓度下的 MA 摄入量均显著高于 MAHDR - Taar1+/+ KI 小鼠。MAHDR - Taar1+/+ KI 小鼠在所有浓度下的 MA 摄入量都较低且相近。这表明敲入功能性 TAAR1（Taar1+）可以将 MAHDR 小鼠的 binge - level MA 摄入转变为低水平摄入，证实了 Taar1 基因在调节 MA 摄入中起因果作用，无功能的 TAAR1 会导致 binge - level MA 摄入。

4. MA 诱导的背侧缝核 5 - HT 神经元增强与 TAAR1 基因型的关系：与 MAHDR 小鼠类似，MAHDR - Taar1m1J/m1J 小鼠的背侧缝核 5 - HT 神经元在 MA 作用下，整体平均放电频率显著增加，RMP 去极化。而 MAHDR - Taar1+/+ KI 小鼠的背侧缝核 5 - HT 神经元在 MA 作用下，放电频率和 RMP 均无显著变化。这进一步证明了 MA 诱导的背侧缝核 5 - HT 神经元活动增强依赖于无功能的 TAAR1。

5. MA 诱导的神经元增强与 SERT 的关系：在记录溶液中加入 AMPA 受体拮抗剂 NBQX（10μM）和 GABA 受体拮抗剂 bicuculline（10μM）以及 5 - HT1A 和 5 - HT1B 自身受体拮抗剂后，MA 对 MAHDR 小鼠背侧缝核 5 - HT 神经元的整体平均放电频率仍有显著增加作用，且使 RMP 去极化，说明这些突触输入不太可能是 MA 诱导神经元增强和去极化的原因。而在加入 SERT 拮抗剂 fluoxetine 后，MA 对 MAHDR 和 MAHDR - Taar1m1J/m1J 小鼠背侧缝核 5 - HT 神经元的放电频率和 RMP 均无显著影响，表明 SERT 是 MA 诱导背侧缝核 5 - HT 神经元放电增强的必要条件，在 MA 诱导的去极化过程中也发挥作用。

研究结论与讨论

研究表明，缺乏功能性 TAAR1 的小鼠在 MA 作用下，背侧缝核 5 - HT 神经元会出现去极化、兴奋性增加的现象，同时表现出 binge - level MA 摄入。MA 通过 SERT 依赖的机制增强背侧缝核 5 - HT 神经元的兴奋性。敲入功能性 TAAR1 可以将 MAHDR 小鼠的 binge - level MA 摄入转变为低水平摄入，这进一步证实了 Taar1 基因对 MA 摄入的因果调节作用，无功能的 TAAR1 是驱动 binge - level MA 摄入的重要因素。

TAAR1 的功能状态介导了 MA 对背侧缝核 5 - HT 神经元活动的影响。在具有功能性 TAAR1 的 MALDR 小鼠中，MA 通过激活 5 - HT 自身受体抑制神经元活动；而在缺乏功能性 TAAR1 的 MAHDR 小鼠中，MA 在 5 - HT 自身受体拮抗剂存在时能够使神经元去极化并增加放电频率。此外，MA 诱导的缺乏功能性 TAAR1 的背侧缝核 5 - HT 神经元的去极化和兴奋性增加依赖于 SERT。一种可能的机制是，MA 作为 SERT 的底物被转运进入神经元，由于 TAAR1 功能缺失，无法使 SERT 内化，从而导致 SERT 依赖的离子电流增加，引起神经元去极化和兴奋性增强。但也不能排除 MA 通过其他途径影响神经元兴奋性的可能性，比如从细胞内空间影响离子通道或激活 TAAR1 信号通路下游的离子通道等，这需要进一步研究确定。

这项研究的重要意义在于，明确了 TAAR1 在调节背侧缝核 5 - HT 神经元兴奋性和 MA 摄入中的关键作用，揭示了 MA 使用障碍与 TAAR1 功能、SERT 活性以及背侧缝核 5 - HT 神经元活动之间的复杂关系。这为深入理解 MA 使用障碍的遗传和分子机制提供了重要依据，有助于发现新的治疗靶点，为开发更有效的 MA 使用障碍治疗方法奠定了基础，对未来攻克 MA 成瘾难题具有重要的指导价值。