5'UTR变异导致的LMX1B单倍性不足是导致指甲-髌骨综合征的原因

　　

探索罕见病根源：LMX1B 基因 5’UTR 变异引发指甲 - 髌骨综合征的深度解析

近期，来自 IRCCS Istituto Giannina Gaslini 的医学遗传学部门（Medical Genetics Unit）等多个单位的研究人员，在npj Genomic Medicine期刊上发表了一篇重要论文 “LMX1B haploinsufficiency due to variants in the 5’UTR as a cause of Nail-Patella syndrome”。这一研究首次揭示了 LMX1B 基因 5’非翻译区（5’UTR）变异在指甲 - 髌骨综合征（Nail-Patella syndrome，NPS）发病机制中的关键作用，为深入理解该罕见病的病因提供了新视角，也为未来的精准诊断和治疗策略开发奠定了基础。

一、研究背景

NPS 是一种罕见的常染色体显性遗传疾病，发病率约为 1/50,000 活产儿。其典型症状包括指甲发育异常、骨骼畸形（如肘、膝关节异常及髂骨角出现），部分患者还伴有肾脏问题（如蛋白尿、血尿，部分可发展为肾小球肾炎甚至终末期肾衰竭）、眼部疾病（青光眼、白内障）和神经系统症状 。NPS 的致病根源是 LIM 同源结构域转录因子 1β 基因（LMX1B）的功能缺失，导致基因单倍体不足。此前研究发现，85% 的患者携带影响 LMX1B 编码序列的点突变或小片段插入 / 缺失，约 15% 的病例存在基因的全部或部分缺失，也有染色体重排涉及 LMX1B 基因座的报道 。然而，部分 NPS 患者并未检测到已知的 LMX1B 基因变异或重排，提示可能存在尚未被发现的变异类型或遗传异质性。

5’UTR 虽不编码蛋白质，但在基因表达的转录后调控中起着关键作用。它包含多种调控元件，如 GC 富集序列、内部核糖体进入位点（IRES）、上游开放阅读框（uORF）等，可通过影响 mRNA 的稳定性、核糖体结合效率和翻译起始等过程，精细调控基因表达水平 。已有研究表明，疾病基因 5’UTR 的致病性变异可通过多种机制影响关键蛋白的表达，进而引发疾病。因此，深入探究 LMX1B 基因 5’UTR 区域的变异，对于全面理解 NPS 的发病机制具有重要意义。

二、研究材料与方法

（一）研究对象

研究纳入了两个不相关的 NPS 家族。患者 1（B481）为 44 岁男性，具有典型的 NPS 临床表现，家族中部分亲属也有类似症状；患者 2（E477）为 65 岁女性，同样表现出 NPS 相关特征，家族中多名成员患病但部分无法参与研究 。研究遵循伦理规范，所有参与者均签署了书面知情同意书。

（二）实验方法

1. 分子遗传学分析：提取患者及亲属的外周血基因组 DNA，对 LMX1B 基因的 8 个编码外显子、相关内含子进行 PCR 扩增和测序分析，利用 MLPA、CGH 阵列等技术检测基因缺失或重复情况，通过常规细胞遗传学分析排除染色体重排 。对于未发现变异的样本，进一步扩展分析 5’UTR 和近端启动子区域。

2. 细胞实验：从患者 1 及其父母的外周血淋巴细胞中建立永生化淋巴母细胞系，利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠（Sodium butyrate）诱导 LMX1B 基因表达，通过 RT-PCR 和 Sanger 测序检测基因表达情况。构建携带野生型和突变型 LMX1B 5’UTR 的报告基因载体，转染 Hek-293 细胞，检测荧光素酶活性，评估变异对基因表达的影响 。同时，构建包含 LMX1B cDNA 的表达质粒，转染 Hek-293 细胞，通过 Western blot 分析检测蛋白表达水平。

3. 功能验证实验：利用嘌呤霉素（Puromycin）抑制无义介导的 mRNA 衰变（NMD）过程，观察其对携带变异转录本表达的影响。设计新的表达载体，使新产生的 uORF 与 LMX1B 主编码序列框内融合，验证变异产生的 ATG 密码子是否能被细胞翻译机制识别利用 。

4. 生物信息学分析：运用 ATGpr 和 NetStart 等在线工具，预测变异引入的新 ATG 密码子能否作为翻译起始位点，评估其周围序列与 Kozak 共识序列的匹配程度，预测 uORF 的产生及潜在影响。

三、研究结果

（一）LMX1B 基因新变异的鉴定

对患者 1 进行全面的分子筛查，未在编码外显子、内含子区域发现致病性变异，排除了基因缺失和染色体重排的可能。进一步分析 5’UTR 和近端启动子区域，发现了一个此前未报道的杂合变异 c.?174C>T，该变异在患者患病父亲中存在，而未患病母亲中缺失，且在公共数据库中未见记录 。同样，患者 2 的编码外显子筛查结果为阴性，在 5’UTR 和近端启动子区域检测到杂合变异 c.?226G>A，该变异在患者患病兄弟中也存在。

（二）LMX1B 基因 5’UTR 区域特征及变异影响预测

LMX1B 基因的 5’UTR 区域约 1.2kb，富含 GC 序列。该区域原本存在两个小的 uORF（uORF1 和 uORF2） 。生物信息学分析显示，c.?174C>T 和 c.?226G>A 变异分别引入了新的 ATG 密码子，可能产生两个新的 uORF（uORF3 和 uORF4）。新产生的 uORF 与 LMX1B 主编码序列部分重叠且框架不同，会导致提前终止密码子的出现，可能引发 NMD，或者翻译出异常蛋白，影响 LMX1B 基因的正常功能。

（三）LMX1B cDNA 分析

在淋巴母细胞系中，丁酸钠能够有效诱导 LMX1B 基因表达。对携带 c.?174C>T 变异的样本进行 Sanger 测序分析发现，在基因组 DNA 中该变异呈杂合状态，而在 cDNA 中野生型和突变型等位基因的峰强度出现失衡，突变型 T 等位基因的峰强度较弱，提示该变异可能影响携带转录本的表达 。

（四）5’UTR 变异的功能特征分析

报告基因实验结果显示，与野生型 5’UTR 相比，携带 c.?174C>T 和 c.?226G>A 变异的 5’UTR 显著降低了荧光素酶活性，分别降低约 95% 和 47%，表明这两个变异均会损害基因表达 。Western blot 分析结果也表明，变异型 LMX1B 蛋白的表达水平明显低于野生型，进一步证实了变异对基因表达的抑制作用。

（五）NMD 在变异转录本降解中的作用

用嘌呤霉素抑制 NMD 后，患者 1 及其患病父亲的携带变异转录本的表达得到恢复，在 cDNA 中野生型和突变型等位基因的杂合性恢复平衡，证实了 NMD 参与了变异转录本的降解过程 。虽然因样本限制未对 c.?226G>A 变异进行同样分析，但推测该变异可能具有类似机制。

（六）新产生 uORF 的作用

通过构建特殊表达载体，使新产生的 uORF 与 LMX1B 主编码序列框内融合，发现细胞能够识别并利用变异产生的 ATG 密码子，翻译出分子量更大的异常 LMX1B 蛋白。这表明如果部分转录本逃脱 NMD，可能会翻译出完全异常的蛋白，影响正常的生物学功能。

四、研究结论与讨论

本研究首次明确了 LMX1B 基因 5’UTR 变异在 NPS 发病中的致病作用。c.?174C>T 和 c.?226G>A 这两个新变异通过引入新的 uORF，在转录后水平损害 LMX1B 基因的表达，导致 LMX1B 单倍体不足，进而引发 NPS。变异产生的 uORF 可通过多种机制影响基因表达，如阻碍核糖体翻译、触发 NMD 降解异常 mRNA、翻译出异常蛋白等。抑制 NMD 能够部分恢复变异转录本的表达，进一步验证了 NMD 在这一过程中的重要作用 。同时，研究还发现变异产生的 ATG 密码子可被细胞翻译机制识别利用，可能产生异常蛋白，干扰正常的细胞功能。

这一研究成果具有多方面的重要意义。在基础研究领域，拓展了对 NPS 发病机制的认识，揭示了 5’UTR 变异作为新的致病因素，丰富了对基因表达调控与罕见病关系的理解。在临床诊断方面，提示在 NPS 的分子诊断中，应将 5’UTR 等非编码调控区域纳入常规检测范围，避免漏诊，有助于提高诊断的准确性和全面性 。从遗传咨询角度，为携带相关变异的家庭提供了更精准的遗传信息，帮助他们更好地理解疾病的遗传风险和传递规律。此外，该研究也为其他罕见病的研究提供了借鉴，强调了非编码区域在疾病发生发展中的重要性，推动了对罕见病发病机制的深入探索，为开发新的诊断和治疗策略提供了理论依据。