Listerin 通过 ESCRT 通路促进 α- 突触核蛋白降解，为帕金森病治疗带来新曙光

本文聚焦帕金森病（PD），发现 E3 泛素连接酶 Listerin 可促进 α- 突触核蛋白（α-syn）的 K27 连接多聚泛素化，经内体分选转运复合体（ESCRT）途径降解 α-syn。Listerin 基因敲除加剧 PD 小鼠神经退行性进展，过表达则缓解症状，有望成为 PD 治疗新靶点。

　　### 引言
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种慢性、进行性的神经退行性疾病，在全球影响着数百万人，且随着全球人口老龄化，其患病率不断上升。PD 的主要特征包括运动症状，如震颤、运动迟缓、肌强直和姿势不稳，以及非运动症状，如认知障碍、情绪紊乱和自主神经功能障碍。目前，PD 的确切生理和病理分子信号机制尚未完全明确，也没有根治方法，因此迫切需要能够阻止或延缓 PD 患者神经退行性进展的干预措施。

异常积累的 α- 突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）被认为是 PD 发病机制的核心因素，它会错误折叠并聚集形成路易小体，干扰神经元的各种功能，导致多巴胺能神经元死亡，进而引发 PD 相关症状。此外，α-syn 的积累还会导致线粒体功能障碍和炎症反应。因此，研究减少 α-syn 积累或促进其清除的方法，对减缓或预防 PD 的进展具有重要意义。

内体分选转运复合体（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）系统在蛋白质和其他细胞成分的分选、运输和降解过程中发挥着关键作用。已有研究表明，ESCRT 系统可能参与了聚集的 α-syn 的分选和隔离，并通过内体途径将其降解。然而，对于通过 ESCRT 途径促进 α-syn 蛋白降解的 E3 泛素连接酶的研究还较为缺乏。

在本研究中，研究人员发现 Listerin 作为一种 E3 连接酶，可通过 ESCRT 途径调节 α-syn 的降解。Listerin 与 α-syn 相互作用并介导其 K27 连接的泛素化，促进 α-syn 在细胞内的分选和降解。Listerin 基因缺失会导致 α-syn 积累增加，加剧 PD 小鼠模型中神经元衰退的症状；而 Listerin 过表达则可改善 α-syn 诱导的神经行为症状，这表明 Listerin 有望成为 PD 治疗的潜在靶点。

结果

1. Listerin 与 α-syn 相互作用并降低其蛋白水平：通过对人 SH-SY5Y 细胞变性裂解物进行免疫沉淀和质谱分析，研究人员发现 E3 连接酶 Listerin 是潜在的 α-syn 相互作用蛋白。共免疫沉淀（Co-IP）实验、体外 Pull-down 实验以及共聚焦显微镜观察结果均证实了 Listerin 与 α-syn 之间存在相互作用。进一步研究发现，Listerin 过表达可使 SH-SY5Y 细胞中 α-syn 蛋白水平呈剂量依赖性下降，对 A53T 突变型 α-syn 蛋白水平也有降低作用。此外，Listerin 还能抑制 α-syn 的聚集，减少 α-syn 单体和寡聚体的水平，降低可溶性和不可溶性 α-syn 蛋白的含量，并且能与重组 α-syn 预形成纤维（PFFs）相互作用并促进其降解。
2. Listerin 提高细胞活力并降低 SNCA 介导的细胞毒性：为研究 Listerin 在 α-syn 介导的细胞毒性中的作用，研究人员构建了神经元中 Listerin 条件性敲除小鼠。实验结果显示，Listerin 敲除的原代神经元中 α-syn 表达水平明显升高，在致病性 PFFs 刺激后，细胞凋亡比例增加，酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）表达下调，乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放增加，线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mitoROS）水平升高，线粒体膜电位降低，ATP 生成减少。而在 SH-SY5Y 细胞中过表达 Listerin，则可抑制 α-syn（A53T）诱导的细胞死亡，阻断 cleaved caspase 3 的表达，逆转 TH 的表达，提高细胞活力，抑制 LDH 释放，降低 mitoROS 水平，增加线粒体膜电位。这些结果表明，Listerin 可降低 α-syn 积累介导的细胞毒性和损伤，提高细胞活力。
3. Listerin 通过 ESCRT 途径促进 α-syn 的降解：研究人员通过测量 α-syn 蛋白的半衰期，发现 Listerin 过表达可加速 α-syn 的降解。进一步研究发现，Listerin 诱导的 α-syn 降解可被晚期内体 / 溶酶体抑制剂 Bafilomycin A1 抑制，但蛋白酶体抑制剂 MG132 对其无影响，且经典自噬途径相关基因 ATG5 和 ATG7 敲除后，Listerin 介导的 α-syn 降解不受影响，这表明 Listerin 促进 α-syn 降解可能不依赖于经典自噬途径。

由于 ESCRT 途径在识别和分选泛素化蛋白中起关键作用，研究人员推测 Listerin 介导的 α-syn 降解可能涉及该途径。共聚焦显微镜观察发现 α-syn 与 Listerin 在内涵体上共定位，且 α-syn 和 Listerin 均与 ESCRT 机制的关键成分 Tsg101 共定位。沉默 ESCRT - 0 复合物的相关蛋白或敲低 VPS4，均可阻碍 Listerin 介导的 α-syn 降解；构建 Hrs 敲除细胞系后，Listerin 不再促进 α-syn 降解。此外，通过构建 GFP - mCherry - SNCA 表达载体并转染细胞，观察到 Listerin 质粒转染后 α-syn 的绿色荧光减少，这表明 Listerin 可介导 α-syn 内化进入酸性多囊泡体。综合以上结果，表明 Listerin 通过 ESCRT 系统在内体中促进 α-syn 的降解。
4. Listerin 依赖其 E3 连接酶活性促进 α-syn 的 K27 连接多聚泛素化：ESCRT 机制负责将泛素化的货物分选到内体进行降解，而 Listerin 具有促进多肽链降解的功能，且含有 RING 结构域。研究人员构建了两个 Listerin 突变体 Listerin (ΔR) 和 Listerin (C/A)，这两个突变体均丧失了潜在的 E3 酶活性。实验结果显示，Listerin (C/A) 和 Listerin (ΔR) 无法降低 α-syn 和 α-syn (A53T) 的蛋白水平，也不能促进 α-syn 的多聚泛素化，而全长 Listerin 过表达则可促进 α-syn 的多聚泛素化，这表明 Listerin 对 α-syn 多聚泛素化的促进作用依赖于其 E3 连接酶活性。

研究人员进一步探究 Listerin 介导的 α-syn 多聚泛素化的具体类型，结果发现 Listerin 促进 α-syn 的 K27 连接多聚泛素化，且 Listerin (C/A) 和 Listerin (ΔR) 无法促进这种多聚泛素化。体外泛素化实验也证实了 Listerin 可催化 α-syn 的 K27 连接多聚泛素化。通过构建一系列 α-syn 突变体，研究人员确定了 Listerin 促进 K27 连接多聚泛素化的 α-syn 的赖氨酸残基为 Lys¹²、Lys²³、Lys⁴⁵和 Lys⁸⁰。此外，研究还发现 α-syn (K4R) 突变体比野生型 α-syn 更容易形成聚集，且其可溶性和不可溶性蛋白水平均高于野生型 α-syn。
5. Listerin 缺失加剧体内 PD 进展：为评估 Listerin 在 PD 中的功能，研究人员将腺相关病毒（adeno - associated virus，AAV）介导的突变型 α-syn [AAV-SNCA (A53T)] 注射到小鼠的黑质纹状体系统中，构建 PD 小鼠模型。实验结果显示，Listerin 敲除的小鼠在埋藏食物颗粒测试中寻找目标食物的时间更长，在开放场测试中在目标气味区域停留的时间更短，在刺激性气味区域停留的时间更长；在杆测试中爬杆到底部的时间增加，在加速转棒测试中保持平衡的时间缩短，在握力测试中握力减弱。此外，Listerin 敲除小鼠黑质中 TH 表达减少，α-syn 磷酸化水平增加，神经元损伤更严重。这些结果表明，Listerin 缺失加剧了 SNCA (A53T) 诱导的 PD 小鼠的嗅觉功能障碍和运动缺陷。
6. Listerin 抑制 A53T 小鼠模型中 α-syn 诱导的病理变化：研究人员开发了用于过表达 Listerin 的腺病毒（Adv），并在 AAV-SNCA (A53T) 诱导的 PD 小鼠模型中进行体内治疗效果研究。结果显示，注射 Adv-Listerin 的小鼠在埋藏食物颗粒测试中定位目标食物的效率提高，在开放场测试中在目标气味区域停留的时间增加；在杆测试中爬杆到底部的时间减少，在加速转棒测试中在旋转杆上的停留时间增加；大脑中 TH 表达增加，磷酸化 α-syn 表达减少，神经元染色增强。这些结果表明，Listerin 对调节 PD 相关的行为症状和病理进展至关重要，是 PD 治疗的有前景的靶点。

讨论

α-syn 的异常积累会破坏正常细胞过程，导致黑质中多巴胺能神经元死亡，因此降解 α-syn 积累对维持神经元健康和预防 PD 至关重要。泛素化是一种翻译后修饰过程，泛素与底物的连接异常与多种疾病相关。已有研究发现多种 E3 连接酶参与 α-syn 的泛素化或降解过程，但仍需进一步研究是否存在其他 E3 泛素连接酶可有效调节 α-syn 的表达并影响 PD。

本研究揭示了 Listerin 作为一种重要的调节因子，依赖 ESCRT 途径减少 α-syn 的蛋白积累。通过构建 Listerin 敲除小鼠和过表达模型，研究人员证实了 Listerin 在调节 PD 病理和行为症状方面的重要作用，这为 PD 治疗提供了新的潜在靶点。

Listerin 在经典的核糖体相关质量控制（ribosome - associated quality control，RQC）途径中，可将 K48 连接的泛素链连接到核糖体上提前终止或停滞的多肽链上，促进其经蛋白酶体降解，对维持细胞内稳态和防止错误折叠蛋白积累具有重要意义。然而，此前对 Listerin 在真核生物中的生理功能研究较少。本研究发现 Listerin 与 α-syn 结合并催化其 K27 连接的多聚泛素化，通过 ESCRT 途径促进其降解，且该过程可能独立于 RQC 系统。此外，本研究还发现 ESCRT 途径不仅可捕获 K63 连接的泛素化蛋白进行降解，K27 泛素化修饰的蛋白也可经该途径转运到内体进行降解，这拓宽了人们对 ESCRT 机制和泛素化调节的认识。

综上所述，本研究表明 Listerin 通过促进 α-syn 的 K27 连接泛素化，经 ESCRT 途径降解 α-syn，为调节 α-syn 降解途径和治疗 PD 提供了新的见解，也为进一步研究 PD 相关过程的潜在治疗途径提供了理论依据。

材料和方法

1. 小鼠：利用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术构建 Listerin^fl/fl小鼠，与 Nestin-Cre 转基因小鼠杂交获得不同基因型小鼠。通过聚合酶链反应（PCR）鉴定小鼠基因型。
2. 细胞培养和转染：培养 SH-SY5Y 和 HEK293T 细胞，使用含 10% 胎牛血清、青霉素和链霉素的培养基，在 37°C、5% CO₂条件下培养。采用 Lipofectamine 3000 进行质粒转染，RNAIMAX 进行 siRNA 转染。
3. 原代神经元培养和处理：从 Listerin^fl/fl和 Listerin^fl/fl Nes-Cre 胚胎中分离原代皮质神经元，培养 7 天后用 α-syn PFFs 处理。
4. 样品制备和 Western blotting：裂解样品，离心后通过 bicinchoninic acid（BCA）法测定蛋白浓度，经 SDS 聚丙烯酰胺凝胶分离，用牛血清白蛋白封闭，与多种一抗和相应二抗孵育检测蛋白表达。
5. 共免疫沉淀：转染 24 小时后获取全细胞提取物进行免疫沉淀，加入 PFFs 处理后，用免疫沉淀缓冲液裂解细胞，按常规方法进行 Co-IP。
6. 体外结合和泛素化测定：采用 TNT Quick Coupled Transcription/Translation System 合成 Listerin 和 α-syn 蛋白，进行体外结合测定；按既定方案进行泛素化实验。
7. 免疫荧光：固定细胞或组织切片，透化、封闭后，与指定抗体孵育过夜，再与荧光标记的二抗孵育，进行免疫荧光染色。
8. 质谱分析：转染 His-SNCA 诱导 SH-SY5Y 细胞过表达 α-syn，提取细胞裂解物进行免疫沉淀，分离蛋白后进行质谱分析。
9. TUNEL 和 LDH 测定：使用细胞毒性检测试剂盒，按说明书进行 TUNEL 测定和 LDH 测定。
10. PI-Hoechst 染色：用 PI 和 Hoechst 染色 5 - 15 分钟，在荧光显微镜下观察并计数凋亡细胞。
11. 完整细胞交联：转染质粒后提取细胞裂解物，用 DSS 处理进行交联。
12. 双分子荧光互补（BiFC）测定：构建 SNCA-BiFC 传感器，在 HEK293T 细胞中稳定表达，检测 α-syn 的聚集。
13. 高内涵成像：转染 GFP-mCherry-SNCA 和 Flag-Listerin 后，用高内涵筛选仪器定时拍摄细胞荧光图像，用 Harmony 软件进行形态分析。
14. 立体定向注射 AAV-SNCA (A53T)：将 AAV-GFP 或 AAV-SNCA (A53T) 注射到小鼠纹状体，注射后监测动物恢复情况，2 个月后进行行为测试和组织生化分析。
15. 埋藏食物颗粒测试：实验前对小鼠进行饮食控制，测试时将食物埋在垫料下，记录小鼠找到食物的时间。
16. 开放场测试：将小鼠置于开放场测试箱中，放置甜玉米和辣椒，记录小鼠在不同区域的停留时间。
17. 握力测试：用握力计测量小鼠前爪的最大握力。
18. 转棒测试：小鼠在加速旋转的转棒上测试，记录其掉落时间，实验前进行 3 天训练。
19. 杆测试：小鼠在包裹绷带的金属杆上测试，记录其下降到底部的时间，实验前进行训练。
20. 统计分析：数据以三次重复实验的平均值 ± 标准差表示，采用 Student’s t 检验或双向方差分析（ANOVA）进行统计分析，P < 0.05 为差异有统计学意义。
21. 研究批准：所有动物实验均符合中国实验动物福利伦理审查指南和山东大学齐鲁医院科研伦理委员会的批准。