靶向探究癌症相关蛋白酶变体的影响：开启肿瘤精准治疗新征程

本文介绍了一种靶向方法（TACAP），用于确定癌症相关蛋白酶变体的影响。通过对 meprin β R238Q 变体的研究，发现其改变了酶的切割特异性、底物池和抑制剂亲和力，且促进了胶质瘤细胞迁移和侵袭，为癌症治疗研究提供了重要依据。

　　

引言

蛋白酶参与众多生理过程，其活性失调与癌症等多种疾病相关。目前已有超 100 种蛋白酶被证实与癌症进展、癌细胞迁移和侵袭有关，如 ADAM10、ADAM17 等通过蛋白水解过程影响癌症发展，MMPs、KLKs、组织蛋白酶（cathepsins）、meprin β 等在癌细胞侵袭和转移过程中降解细胞外基质（ECM）等结构。此外，癌症发展还与血管生成和炎症密切相关，部分蛋白酶在此过程中发挥重要作用，例如 meprin β 能激活促炎细胞因子。基于蛋白酶在癌症中的促肿瘤功能，其成为潜在的癌症治疗药物靶点，蛋白酶抑制剂也被用于癌症治疗的研究，虽部分已获 FDA 批准，但早期一些小分子蛋白酶抑制剂因特异性不足和副作用问题在临床试验中失败，近年来则有更具治疗潜力的特异性蛋白酶抑制剂被研发。

癌细胞和肿瘤微环境中的蛋白水解活性常处于失调状态，多种因素可导致这种情况，同时，人类癌症样本的基因组研究发现蛋白酶基因中存在大量单核苷酸变异（SNVs），这些变异可能影响蛋白水解活性，即便只有一个氨基酸发生改变的变体，其在切割特异性、底物池、定位及对肿瘤发生的影响等方面也可能与野生型（WT）蛋白酶存在显著差异。然而，目前对癌症相关蛋白酶变体的研究还较为匮乏，研究这些变体对肿瘤发生的影响，以及对潜在治疗性蛋白酶抑制剂、前药和抗体的疗效影响至关重要。因此，本文开发了一种研究癌症相关蛋白酶变体的工作流程（TACAP），并以 meprin β 变体 R238Q 为例进行研究，揭示该变体与野生型相比，在切割特异性、底物池和抑制特性方面存在显著变化。

结果

1. 半自动化识别潜在调节切割特异性的癌症相关蛋白酶变体：在 COSMIC 数据库中，大量癌症样本的蛋白酶基因存在突变，如 meprin β 基因有众多突变，且多数位于外显子，部分位于催化结构域，可能影响酶的特异性和底物切割。为此开发了催化相关不规则残基分析仪（CAIRA），它能基于蛋白酶的 UniProt ID 和 AlphaFold 预测结构，筛选 COSMIC 数据库中活性位点周围可能调节切割特异性的 SNVs，并在可下载的 pdb 文件中标记受影响氨基酸。利用 CAIRA 分析 meprin β，发现 R238Q 变体是有研究潜力的候选 SNV，该变体出现在多种癌症中，其影响的精氨酸位于活性位点裂隙的 S1′亚位点，与底物相互作用密切，因此推测其替换为谷氨酰胺会影响 meprin β 的切割特异性，尤其是对 P1′位置的影响。
2. PICS 分析揭示 meprin β R238Q 切割特异性的重大变化：通过基于质谱（MS）的蛋白酶切割位点蛋白质组学鉴定（PICS）分析 meprin β R238Q 的切割特异性。结果显示，meprin β WT 对切割位点周围的酸性氨基酸有强烈偏好，在 P1′位置尤其倾向于天冬氨酸和谷氨酸，而 meprin β R238Q 由于 S1′位置的氨基酸替换，失去了对酸性氨基酸的偏好，转而更倾向于丙氨酸。这一变化在仅分析 meprin β WT 或 R238Q 处理样本中特有的肽段时更为明显。此外，通过淬灭荧光肽切割试验进一步验证了这一结果，meprin β WT 能切割富含酸性氨基酸的肽段，而 meprin β R238Q 则不能，且 P1′位置的酸性氨基酸会阻碍 meprin β R238Q 的切割。基于 PICS 结果设计的（mca）-EDAEDA-（dnp）肽段可被 meprin β R238Q 切割，虽效率不如 WT，但可用于后续对该变体的研究。
3. meprin β WT 和 R238Q 在定位和脱落方面无差异，但在激活方面存在差异：氨基酸替换可能影响蛋白质的分选、转运、折叠等，进而影响其定位和功能。通过细胞表面生物素化试验和共聚焦显微镜观察发现，meprin β WT 和 R238Q 在细胞表面的定位无明显差异，且二者都能被 ADAM10/17 等蛋白酶从细胞表面脱落，以可溶性形式存在于细胞外空间。研究还发现，meprin β WT 和 R238Q 都以无活性的前体形式被分泌，需经胰蛋白酶等激活，且 meprin β R238Q 在细胞表面的激活比例高于 meprin β WT。
4. 癌症相关的 meprin β 变体 R238Q 改变了对蛋白酶抑制剂的亲和力：在癌症治疗中，蛋白酶抑制剂是重要的研究方向，需评估其对蛋白酶变体的抑制效果。研究中测试了两种抑制剂对 meprin β WT 和 R238Q 的抑制作用，结果显示，放线菌素（actinonin）对 meprin β R238Q 的抑制能力比 WT 更强，几乎与对 meprin α 的抑制效果相当；而基于膦酸的肽抑制剂（F2）对 meprin β WT 的选择性更高，对 R238Q 的抑制效果则明显降低。这表明分析蛋白酶抑制剂对特异性调节 SNVs 的影响对揭示其临床意义至关重要。
5. N 端组学鉴定出 meprin β R238Q 和 meprin β WT 底物池的差异：meprin β WT 和 R238Q 切割特异性的变化暗示其对天然蛋白质底物的切割可能不同。利用基于 MS 的疏水标记辅助 N 端富集（HYTANE）分析（一种终端胺同位素标记底物（TAILS）的变体）进行 N 端组学研究，以人胶质瘤细胞系 U251MG 为研究对象，检测癌症相关天然底物切割的差异。结果显示，meprin β WT 对 P1′位置的酸性氨基酸有明显偏好，而 R238Q 则偏好丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸等小氨基酸，且表达 meprin β R238Q 的细胞中检测到的切割事件更多。对胶质瘤相关蛋白的分析发现，细胞黏附分子 CD99 和蛋白聚糖 syndecan-1 等在 meprin β WT 和 R238Q 作用下的切割位点存在显著差异。
6. meprin β WT 和 R238Q 对多种蛋白质底物的切割存在差异：通过蛋白质免疫印迹（Western blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）分析进一步验证底物池的切割差异。研究发现，淀粉样前体蛋白（APP）、syndecan-1、CD99 和 IL-6R 等都是 meprin β 的底物，且 meprin β WT 和 R238Q 对它们的切割存在差异。例如，meprin β R238Q 对 APP 的切割效率更高，产生的 sAPPβ + Asp 和 Aβ_x-40 水平更高，且 N-APP11 片段在 meprin β R238Q 作用下无法检测到；对于 syndecan-1，meprin β R238Q 产生的主要切割片段显著增加；CD99 在 meprin β WT 和 R238Q 作用下的切割片段大小和水平也有所不同；meprin β R238Q 对 IL-6R 的蛋白水解活性则低于 meprin β WT。
7. meprin β WT 和 R238Q 的表达促进胶质瘤细胞的迁移和侵袭：TACAP 还研究了癌症相关蛋白酶变体对肿瘤细胞生物学功能的影响。以人胶质瘤细胞系 U251MG 和小鼠胶质瘤细胞系 GL261 为模型，发现这两种细胞系内源性 meprin β 表达较低或无表达。功能实验表明，meprin β WT 和 R238Q 的表达均能促进胶质瘤细胞的迁移和侵袭，在多种实验模型中，如体外跨内皮迁移（TEM）实验、三维（3D）肿瘤球侵袭实验、体内器官型脑片培养实验以及 Transwell 迁移和侵袭实验中，表达 meprin β WT 或 R238Q 的细胞迁移和侵袭能力均显著增强，且 meprin β R238Q 在某些实验中表现出比 meprin β WT 更强的侵袭能力。此外，研究还发现催化活性丧失的 meprin β 变体 E153A 也能促进肿瘤球的迁移，推测可能存在非催化作用机制。同时，通过抑制剂实验发现，不同抑制剂对 meprin β WT 和 R238Q 的抑制效果不同，这与之前体外实验中观察到的抑制剂特性差异相符，表明这些差异可能源于 meprin β WT/R238Q 对 ECM 成分的蛋白水解加工。

讨论

癌细胞的增殖和迁移可因蛋白酶异常活性导致底物切割改变而增强，因此，对疾病相关蛋白酶活性模式进行诊断分析有助于评估生物标志物、患者预后和治疗方案。大规模基因分型发现蛋白酶基因存在多种癌症相关突变，标准化研究这些变体有助于设计更有效的个性化癌症治疗方案。

本文开发的 TACAP 方法可用于蛋白酶变体的生化和功能表征，其包含的 CAIRA 程序能半自动化识别潜在调节切割特异性的 SNVs。以 meprin β 为研究对象，通过 TACAP 流程分析 R238Q 变体发现，该变体导致 meprin β 对 P1′位置酸性氨基酸的偏好丧失，同时在定位和脱落方面与 WT 无差异，但激活略有增加。此外，TACAP 分析发现 meprin β R238Q 对多种底物的切割与 WT 存在差异，这些差异可能影响癌细胞的增殖和迁移，例如 syndecan-1、CD99 和 IL-6R 的切割变化与癌症进展相关。在细胞迁移实验中，meprin β WT 和 R238Q 均表现出促迁移作用，可能与它们对 ECM 成分的蛋白水解加工有关，且非催化作用也可能参与其中。

癌症相关 SNVs 还可能影响抑制剂的疗效，开发针对癌症相关变体而非 WT 蛋白酶的选择性抑制剂，有望避免因干扰 WT 蛋白酶生理功能而产生的毒性副作用。例如，对 meprin β 抑制剂的研究发现，R238Q 变体对不同抑制剂的亲和力与 WT 存在差异，这表明了解癌症相关变体对于预测已知蛋白酶抑制剂的疗效和设计有效的变体特异性蛋白酶抑制剂至关重要。

TACAP 方法可轻松应用于其他癌症相关蛋白酶，结合体内碱基编辑的小鼠模型，有助于深入了解蛋白酶在癌症中的作用，预测患者预后并开发新的癌症治疗方案。

材料和方法

1. 化学试剂：实验中使用的化学试剂均为分析级，购自 Carl Roth、Gibco、Merck、MilliporeSigma 或 Thermo Fisher Scientific 等公司，引物由 Merck 合成。
2. F2 膦酸抑制剂的合成：采用基于构建模块的方法合成 F2 膦酸抑制剂，经过多步反应，最终通过色谱分离得到目标抑制剂。
3. 细胞培养和瞬时转染：多种细胞系（如 HEK 293T、HEK 293T ADAM10/17^?/?、U251MG、GL261 等）在特定条件下培养，通过瞬时转染将质粒 DNA 导入细胞，使其过表达特定目标蛋白。
4. 使用的质粒和克隆：实验使用多种质粒进行瞬时转染，其中编码 meprin β 变体 R238Q 的质粒通过定点突变技术构建，并经测序验证。
5. 基因组 DNA 的分离和 meprin β 基因 238 位氨基酸的测序：从 U251MG 和 GL261 细胞中分离基因组 DNA，通过 PCR 扩增包含 meprin β 基因 238 位氨基酸编码核苷酸的片段，经纯化后进行 Sanger 测序，以确定细胞中 meprin β 的形式。
6. 细胞收获和裂解：转染后细胞在特定条件下培养，更换为无血清培养基，部分细胞用 γ - 分泌酶抑制剂 DAPT 处理，收获细胞后进行裂解，离心去除细胞碎片，测定裂解物中的蛋白质浓度。
7. 细胞上清液的超速离心和 TCA 沉淀：对细胞上清液进行超速离心，然后用三氯乙酸（TCA）沉淀浓缩可溶性蛋白质，沉淀经处理后用于后续分析。
8. SDS - PAGE 和 Western blot 分析：蛋白质经 SDS - PAGE 分离后转移到聚偏二氟乙烯膜上，进行 Western blot 分析，使用多种抗体检测目标蛋白，通过化学发光法检测信号。
9. 考马斯亮蓝染色：用于可视化丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
10. 细胞表面生物素化试验：对转染细胞进行细胞表面生物素化处理，通过与链霉亲和素磁珠结合富集细胞表面蛋白，经处理后进行 SDS - PAGE 和 Western blot 分析。
11. Aβ_x-40 ELISA：采用 ELISA 方法定量检测转染 HEK 293T 细胞培养基中释放的 Aβ_x-40，通过一系列操作，包括包被捕获抗体、封闭、孵育样品和检测抗体、显色等步骤，测定吸光度并计算 Aβ_x-40 的浓度。
12. 淬灭荧光肽切割试验：通过检测蛋白酶对特定荧光肽底物的切割活性来定量蛋白酶活性，将表达不同 meprin β 变体的细胞、细胞上清液或纯化蛋白酶与荧光肽底物混合，在特定条件下测量荧光强度随时间的变化，计算相对蛋白酶活性。
13. 免疫荧光染色：对 HEK 293T 细胞和肿瘤球进行免疫荧光染色，用于观察蛋白的定位和表达情况，经过固定、通透化、封闭、孵育抗体等步骤，最后用共聚焦激光扫描显微镜观察。
14. 流式细胞术分析：利用流式细胞术分析细胞表面激活的 meprin β 变体的相对水平，通过免疫荧光染色标记细胞，使用特定抗体和流式细胞仪进行检测和分析。
15. mRNA 分离、cDNA 转录和 RT - qPCR：从细胞中分离 RNA，转录为 cDNA 后进行 RT - qPCR 分析，使用特定引物扩增目标基因，以 GAPDH 为内参基因，计算目标基因的相对表达量。
16. PICS 分析：包括样品制备、LC - MS 测量和数据库搜索与统计等步骤。样品制备过程中，免疫沉淀 meprin β 变体，制备肽库并进行消化、标记等处理；LC - MS 测量在特定仪器上进行，设置相应参数；数据库搜索使用特定算法，设置多种参数进行数据处理和分析，相关数据已存入 ProteomeXchange Consortium。
17. N 端组学（HYTANE）分析：同样包括样品制备、LC - MS 测量和数据库搜索与统计。样品制备针对 U251MG 细胞，经过转染、细胞处理、蛋白质沉淀、标记等多步操作；LC - MS 测量仪器和参数与 PICS 分析类似；数据库搜索使用特定算法和参数进行数据处理和分析，数据也存入了 ProteomeXchange Consortium。
18. 纤连蛋白和胶原蛋白 IV 的蛋白水解加工：从转染细胞的上清液中纯化 meprin β 变体，激活后与纤连蛋白和胶原蛋白 IV 孵育，添加抑制剂，通过 SDS - PAGE 和考马斯亮蓝染色或 Western blot 分析蛋白水解加工情况。
19. TEM 试验：通过 TEM 试验分析表达不同 meprin β 变体的 U251MG 细胞穿过内皮细胞层的迁移情况，将内皮细胞铺板培养至汇合，标记 U251MG 细胞后加入上层培养，孵育后观察和计数迁移细胞。
20. 肿瘤球的生成和培养：将胶质瘤细胞系 U251MG 和 GL261 细胞接种、转染后，在特定条件下培养形成肿瘤球。
21. 3D 肿瘤球侵袭试验：对 U251MG 细胞来源的肿瘤球进行 3D 肿瘤球侵袭试验，在肿瘤球上添加基底膜基质，定时拍照并使用 ImageJ 分析侵袭情况。
22. 通过 Matrigel / 纤连蛋白包被的小室侵袭试验：用纤连蛋白或 Matrigel 包被小室，将转染后的 U251MG 细胞与抑制剂预孵育后加入小室上层，培养后去除未侵袭细胞，染色并测量侵袭细胞的吸光度以评估侵袭能力。
23. 动物：使用 C57BL/6 WT 小鼠，在符合伦理标准的条件下饲养，用于获取器官制备脑片。
24. OBSC 和肿瘤球注射：制备小鼠的离体器官型脑片培养物，将标记的肿瘤球植入脑片培养物中，共培养后固定、澄清，使用显微镜观察和分析肿瘤球的侵袭情况，同时进行活性测定。
25. 切割特异性图谱的生成：根据 N 端组学和 PICS 分析检测到的肽段生成切割特异性图谱，通过比较氨基酸频率计算差异并以特定方式展示。
26. CAIRA 的编程：CAIRA 使用 python 3.12.5 编程，整合多种数据资源，可筛选潜在调节切割特异性的 SNVs，其 logo 由 Adobe Firefly 设计，可在 DRYAD 获取。
27. 数据和统计分析以及图示：使用 ImageJ 进行图像分析，GraphPad Prism 10 软件进行统计分析，采用多种统计方法，以 P < 0.05 为有统计学意义。使用 Photoshop、Microsoft PowerPoint、BioRender.com等工具创建图表，使用