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推荐阅读：本文聚焦植物再生研究，发现细菌纤维素（BC）能诱导非分生组织植物组织创伤后再生。其通过激活细胞分裂素和防御反应，调节 WRKY8 等关键因子，调控 ROS 稳态，为植物伤口愈合提供新策略，值得相关领域研究者关注。
### BC 促进植物叶片伤口再生
植物拥有强大的再生能力，可在受伤后重新生长受损组织。在过去，人们已知植物再生主要通过外源性激素诱导，如体细胞胚胎发生或愈伤组织形成。然而，对于植物再生的分子和细胞机制，人们的了解还不够全面。同时，伤口愈合与防御机制之间的关系也尚不明确。细菌纤维素（BC）在人类生物医学中应用广泛，可作为组织再生的支架。本研究旨在探究 BC 对植物再生的影响。
研究人员以 3 周龄本氏烟草（Nicotiana benthamiana）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）为实验材料，在其叶片上制造伤口，然后覆盖 BC 薄膜，以未覆盖的伤口作为对照。实验结果令人惊喜，7 天后，BC 处理组的伤口愈合率显著高于对照组。在本氏烟草叶片中，BC 处理组超 80% 的伤口愈合，而对照组仅有不到 20%；在拟南芥叶片中，BC 处理组超 75% 的伤口愈合，对照组仅约 25%。扫描电子显微镜（SEM）观察发现，BC 处理的叶片伤口紧密闭合，有新组织形成，而对照组伤口仍开放，无明显细胞增殖迹象。此外，通过多种显微镜观察发现，BC 处理组伤口附近细胞含有许多叶绿体，且有淀粉粒积累，表明细胞功能正常，而对照组细胞则显示出高应激和衰老症状。同时，研究人员还发现，与植物纤维素（PC）或琼脂糖相比，BC 促进伤口愈合的效果更显著，这表明 BC 的独特特性在促进植物再生中发挥了重要作用。
进一步研究发现，BC 在叶片不同部位（叶尖、叶中、叶基）均能有效促进伤口愈合，这表明 BC 可诱导非分生组织细胞再生，且不受其他内源性因素的影响。
BC 驱动特定的时间转录重编程
为深入探究 BC 介导再生的内源性调控机制，研究人员对伤口区域进行了转录组分析（RNA 测序，RNA-seq）。他们在拟南芥叶片伤口覆盖 BC 或不覆盖，在 0、3、6 和 24 小时后收集伤口周围 1 毫米区域的样本进行 RNA-seq 分析。
差异表达基因（DEG）分析显示，从 3 小时起，基因开始迅速激活或抑制，共检测到 7585 个独特的 DEG。通过 K - 均值聚类分析，这些 DEG 被分为 7 个类别，呈现出不同的表达模式。其中 4 个聚类对应被 BC 迅速激活、早期激活、晚期激活或延迟激活的基因，另外 3 个聚类对应被 BC 迅速抑制、晚期抑制或持续抑制的基因。
为验证研究方法的有效性，研究人员选取了一些高表达且变化较大的基因制备突变体。结果发现，多数突变体（19 个中有 16 个）在再生过程中出现变化，这表明该方法能够有效识别参与 BC 介导再生的调控成分。
基因本体（GO）富集分析表明，不同聚类在不同的 GO 类别中富集，且多数聚类在京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路中也有独特富集，这意味着在 BC 介导的再生过程中，某些生物学功能是按特定时间顺序调控的。例如，在早期，与光合作用相关的基因被抑制，这可能与 BC 覆盖叶片影响光照有关；而在后期，与细胞能量产生、色氨酸和吲哚相关化合物代谢等过程相关的基因被激活，其中参与生长素稳态调节的尿苷 5′- 二磷酸葡萄糖基转移酶 UGT74E2 基因属于晚期激活基因，其突变体再生能力改变，暗示生长素结合可能是再生的限制因素。
细胞分裂素参与 BC 介导的伤口再生
伤口会触发植物的再生过程，并激活多种激素反应，其中细胞分裂素反应在植物再生中起着关键作用。研究人员对与细胞分裂素反应、信号传导、代谢、生物合成和运输相关的 GO 类别中的 DEG 表达谱进行分析，发现细胞分裂素相关基因在 BC 介导的再生过程中呈现明显的激活特征。其中，被激活的细胞分裂素相关基因多为 “细胞分裂素反应” 和细胞分裂素代谢过程的正向调节因子，而被抑制的基因则多为 “细胞分裂素反应 ” 的负向调节因子。
由于产生纤维素的细菌（如木醋杆菌Komagataeibacter xylinus）能产生植物激素，研究人员推测 BC 中可能含有促进植物组织再生的激素。通过高压液相色谱 - 质谱分析，发现 BC 中含有细胞分裂素（主要是反式玉米素tZ）和生长素（吲哚 - 3 - 乙酸IAA），且含量处于调节植物发育的范围内。
为验证这些激素对伤口再生的重要性，研究人员用无水乙醇洗涤 BC 以降低其激素浓度，然后将其浸泡在 6 - 苄氨基嘌呤（BAP）/ 萘乙酸（NAA）溶液或水中，再应用于受伤的拟南芥叶片。结果显示，无激素的洗涤 BC 再生率较低，而浸泡激素后的 BC 再生率有所提高，但仍未达到标准 BC 的水平，这表明 BC 中的激素传递对再生很重要，同时 BC 的其他理化性质也可能有助于其诱导再生的能力。
此外，研究人员在体外培养本氏烟草叶片圆盘时发现，BC 能诱导愈伤组织形成，而 PC 仅偶尔在受伤叶脉边缘形成愈伤组织，未覆盖的叶片圆盘则无愈伤组织形成。当增加生长素浓度时，只有覆盖 BC 的叶片圆盘出现根增殖。这些结果表明，BC 中天然存在的激素可在体外诱导植物再生，可能在体内也对伤口再生起到重要作用。
研究人员还比较了拟南芥野生型（WT）与生长素和细胞分裂素信号突变体的再生能力。结果发现，生长素信号突变体iaa28-1与 WT 在叶片伤口再生方面无明显差异，而细胞分裂素信号缺陷的ahp2,4,5和ahp1,2,3突变体再生能力显著下降。综合这些结果，表明细胞分裂素信号在 BC 介导的再生中起重要作用。
BC 激活非经典再生程序
研究人员在分析 BC 介导再生的转录组数据时发现，持续被抑制的基因（聚类 2）在茉莉酸（JA）反应相关的 GO 类别中富集，这引发了他们对 JA 反应在 BC 介导再生中作用的探究。
他们利用COI1基因缺陷的coi1-1突变体进行再生实验，发现与 WT 相比，该突变体在覆盖 BC 或不覆盖 BC 时的再生能力无显著差异。同时，研究人员未检测到伤口诱导的茉莉酸信号网络在 BC 介导再生过程中的特异性调节，相关关键基因如乙烯反应因子 109（ERF109）不是 DEG，仅ERF115有轻微诱导。此外，参与茉莉酸信号网络驱动再生的干细胞调节因子，如 SHORTROOT、SCARECROW 和 CYCD6;1 等，在转录组数据中也不是 DEG。
将本研究的数据集与已知的植物再生基因调控网络（GRN）进行比较，发现与核心整合调节因子的重叠较少，且无显著富集。分析 BC 的 DEG 表达模式发现，仅有少数基因被 BC 激活，部分核心整合调节因子如WIND1/RAP2-4甚至被 BC 处理下调，这可能解释了为什么仅检测到伤口诱导愈伤组织反应的部分激活。有趣的是，研究人员检测到伤口和伤口 + 愈伤组织诱导培养基（CIM）诱导的上游 GRN 子网有富集，但其中约 30% 的调节因子被激活，约 15% 被抑制，这也解释了核心整合调节因子未被一致激活的原因。
BC 激活与生物反应相关的特定转录程序
研究发现，在被 BC 迅速激活（从 3 小时起）或晚期激活（24 小时）的基因中，有许多与对外界和生物刺激的反应相关。之前的突变体分析也表明，参与防御机制的基因（如CYP71B15、IOS1、PP2A5和WRKY48）突变会影响植物再生，这些基因可帮助植物抵御病原菌。
由于激活的基因中氧化应激反应、氧化剂解毒和谷胱甘肽转移酶活性等 GO 类别富集，研究人员推测生物应激反应基因的诱导与防御反应中典型的活性氧（ROS）爆发可能导致氧化应激反应和谷胱甘肽转移酶基因的激活。实验结果也证实，BC 处理后，伤口部位的超氧阴离子和其他 ROS 物种积累增加。
WRKY8 子网诱导伤口部位 ROS 稳态并介导 BC 诱导的植物再生
ROS 稳态对调节细胞增殖与分化的平衡至关重要，超氧阴离子积累与细胞增殖相关。鉴于 BC 处理后伤口部位 ROS 稳态改变，且晚期激活基因（聚类 1）中与 ROS 相关的 GO 类别富集，研究人员通过树回归方法对聚类 1 中的基因进行 GRN 推断，并结合 DAP-seq 数据，构建了基因调控网络。
分析该网络发现，约 20% 的目标节点与 ROS 相关，如氧化还原酶、过氧化物酶、抗氧化剂和谷胱甘肽转移酶活性相关基因，或对氧化应激有反应的基因。进一步分析上游调控发现，存在一个紧密相连的转录因子（TF）簇，其中 WRKY8 的聚类系数在 TF 中排名前五，且是该排名中唯一对氧化应激有反应且变化倍数最高的 TF，因此研究人员将重点聚焦于 WRKY8。
WRKY8 的许多 TF 邻居（19 个中有 6 个）也是 WRKY TF，在这个簇中，WRKY8 处于层级结构的关键位置。WRKY8 簇的一些靶基因包括已知调节 ROS 稳态的基因，如 NADPH 呼吸爆发氧化酶蛋白 D 基因（RBOHD）、过氧化物酶和谷胱甘肽 S - 转移酶（GST）基因等。其中，GSTF7 的变化倍数最高，且是 WRKY8 的直接靶基因，通过共表达分析证实了 WRKY8 与 GSTF7 启动子的相互作用。
分析WRKY8和GSTF7的表达模式发现，WRKY8的激活略早于GSTF7。通过将WRKY8和GSTF7启动子与绿色荧光蛋白（GFP）融合进行转录融合实验，发现 BC 处理后，伤口附近细胞中这两个基因的启动子活性在 12 小时后显著增加，且随着时间推移差异更明显。在wrky8-1突变体中，GSTF7的表达水平显著降低，进一步证实了 BC 介导的GSTF7激活依赖于 WRKY8。
再生实验表明，wrky8突变体和gstf7突变体的 BC 介导再生能力均显著低于 WT，且突变体伤口部位的超氧阴离子和其他 ROS 物种积累也明显减少。这些结果表明，BC 介导的植物再生过程中，WRKY8 和 GSTF7 可调节伤口部位的 ROS 积累，对再生起到重要作用。
研究讨论
BC：植物中一种新发现的再生诱导剂
细胞分裂素、生长素和茉莉酸信号网络在植物再生反应中起重要调控作用，但植物非分生组织的再生能力有限，且外源性诱导再生的方法也十分有限。本研究首次发现，BC 可诱导植物创伤后再生，是一种全新的外源性再生诱导剂。
BC 具有独特的理化性质，如高物理和热抗性、纳米多孔结构、强亲水性等，这些特性使其在生物医学等领域广泛应用。同时，BC 的主要产生菌是一种植物相关细菌，且其纯化方法简单、成本低，所得材料纯度高、无细胞毒性，使其成为极具潜力的植物伤口愈合材料。
植物和动物在伤口愈合过程中有一些相似之处，如细胞增殖和分化，以及激素信号传导介导的再生程序。BC 处理植物叶片伤口可促进细胞增殖、组织形成和激素信号传导，表明一些在动物中被认为特有的再生机制，可能在植物 BC 介导的再生中也存在，如激活免疫反应预防感染等。此外，BC 的高保水性等在动物组织再生中发挥重要作用的特性，也可能对植物再生至关重要。
BC 靶向多种再生机制
愈伤组织形成通常被认为是植物再生组织和器官的重要机制，细胞分裂素生物合成是伤口愈合和愈伤组织形成的关键步骤。本研究中，RNA-seq 数据显示 BC 介导的再生过程中细胞分裂素反应被激活，且 BC 中含有细胞分裂素，细胞分裂素信号缺陷的ahp突变体在 BC 介导的再生中效率降低，这些都表明细胞分裂素信号在 BC 介导的再生中起着不可或缺的作用。
虽然 BC 中含有生长素，但在 BC 处理的样本中未检测到生长素相关基因的差异表达，且生长素信号缺陷的突变体在 BC 介导的再生中无明显缺陷。不过，BC 可在体外诱导愈伤组织形成，且添加生长素可促进 BC 介导的根形成，这表明生长素反应可能受体内机制限制，而适当的细胞分裂素 - 生长素平衡对伤口再生十分重要，BC 在体内驱动再生可能还需要其他机制协同细胞分裂素发挥作用。
茉莉酸在植物再生中曾被认为有重要作用，但在本研究中，茉莉酸信号相关基因在 BC 处理样本中部分被抑制，且coi1-1突变体（茉莉酸信号缺陷）不影响 BC 的再生能力，表明茉莉酸在 BC 介导的再生中似乎不起主要作用。
转录分析还发现，BC 介导的伤口愈合早期与愈伤组织形成有一些相似的转录特征，但细胞增殖受到限制，未形成大量愈伤组织，这意味着可能有不同于愈伤组织形成的其他发育或再生程序参与其中。
BC 介导的替代再生途径：防御基因作为植物再生的效应因子
除细胞分裂素外，本研究还发现了 BC 介导再生过程中的其他重要机制。BC 处理可激活与生物和氧化应激反应相关的基因，其中转录因子 WRKY8 在 BC 介导的植物再生中起关键调节作用。研究表明，BC 应用可同时激活细胞分裂素和防御反应，这是再生所必需的。
防御和发育通常相互关联，且往往存在拮抗关系，但 BC 对防御的轻度激活可能打破了防御对发育的抑制。一方面，BC 介导的再生过程中，与水杨酸（SA）反应相关的基因未被差异调节，而高 SA 水平通常会抑制发育；另一方面，BC 通过 WRKY8 网络激活与 ROS 稳态相关的防御基因，而非 SA 反应相关基因，这可能是 BC 促进再生的原因。
WRKY8 可激活 ROS 反应基因，如谷胱甘肽转移酶基因，这些基因可调节伤口部位的 ROS 积累。谷胱甘肽转移酶在应对氧化应激的同时，可能还具有调节细胞周期和促进细胞分裂的潜在作用，这或许可以解释为什么 GSTF7 及其上游调节因子 WRKY8 对 BC 介导的再生至关重要。
细胞周期与 ROS 稳态密切相关，ROS 稳态可调节细胞增殖与分化的转换。BC 处理可导致细胞分裂素激活、ROS 积累和再生，表明细胞分裂素和 ROS 稳态的同时激活可能是 BC 介导再生的关键因素。综上所述，本研究揭示了 BC 可激活一种不同于愈伤组织形成的替代再生途径，为植物再生研究提供了新的视角和策略。
