非 stop 突变 “搅局” 肾癌抑制蛋白 VHL 和 BAP1，多层面影响蛋白翻译

本文聚焦肾癌相关研究，发现肿瘤抑制基因 BAP1 和 VHL 存在非 stop 突变。BAP1 突变致蛋白翻译减少，VHL 突变引发蛋白降解及翻译起始位点改变，还发现 VHL 生殖系突变与严重疾病表型相关，为肾癌研究提供新视角。

　　### 引言
非 stop 突变（Nonstop mutations），也叫 stop-loss 等突变，会把终止密码子变成有义密码子，让翻译延伸到信使核糖核酸（mRNA）的 3′非翻译区（3’UTR），直到遇到下一个框内终止密码子，结果就是蛋白质的 C 末端延长。要是翻译机制没碰到第二个终止密码子，就会到达 mRNA 的多聚 A 序列，出现翻译通读现象，mRNA 也会通过无终止降解途径被降解。从蠕虫到人类，跨物种研究表明翻译越过正常终止密码子通常对蛋白质表达不利。生物信息学分析显示，99% 的人类 mRNA 在 3’UTR 有框内终止密码子，这意味着人类蛋白质组终止密码子的突变可能产生新的 C 末端，带来潜在的病理后果。

在癌症遗传学领域，非 stop 突变的功能意义常被忽视，研究重点多在错义、无义点突变上。一些研究只是提到癌症样本中有非 stop 突变，却没探究其功能影响。不过，已有研究揭示了肿瘤抑制基因 SMAD4 非 stop 突变会导致蛋白质经蛋白酶体降解，还有研究表明肿瘤抑制基因 PTEN 的非 stop 突变也会因 C 末端疏水延伸引发蛋白酶体降解。此前，研究人员创建了癌症体细胞非 stop 突变数据库 NonStopDB，本研究在此基础上进一步探索，发现肿瘤抑制基因 Von Hippel-Lindau（VHL）和 BRCA1 Associated Protein 1（BAP1）的非 stop 突变在肾癌中富集，且这些突变通过不同机制影响蛋白质表达和翻译过程。

结果

1. 肾癌中肿瘤抑制基因 VHL 和 BAP1 存在非 stop 突变：通过泛癌分析搜索有潜在功能相关性的非 stop 突变，研究人员发现，在 COSMIC v98 数据库里，3349 个基因存在癌症相关的非 stop 突变，其中 260 个基因同时频繁受点突变影响。在这 260 个基因中，PIK3CA、PTEN、SMAD4、VHL 和 BAP1 这 5 个基因在 5 名及以上患者中出现复发性非 stop 突变，且在 TCGA 泛癌点突变数据里突变频率超 2%。这 5 个基因里，有 4 个（VHL、BAP1、SMAD4 和 PTEN）是肿瘤抑制基因，表明非 stop 突变在肿瘤抑制基因中富集。进一步分析发现，VHL 和 BAP1 的非 stop 突变在肾癌中特异性富集，且这两个基因的其他点突变也在肾癌中呈现组织特异性富集。此外，VHL 非 stop 突变还在肾上腺嗜铬细胞瘤中被发现，BAP1 的一些点突变在眼部葡萄膜黑色素瘤中存在。

研究人员利用 CRISPR-Cas 系统对人类胚胎肾（HEK）293 细胞系进行精准基因编辑，构建了内源性突变细胞系。对于 BAP1 基因，使用酿脓链球菌（Sp）Cas9；对于 VHL 基因，使用 Acidaminococcus sp.（As）Cas12，基于原间隔相邻基序（PAM）序列可用性和不同的同源定向修复（HDR）效率进行操作。为排除克隆特异性影响，对每个突变的多个克隆进行培养和分析，并通过桑格测序验证野生型（WT）和纯合非 stop 突变细胞系。
2. BAP1 的非 stop 突变因翻译减少导致蛋白质缺失：在 HEK293 细胞中构建 3 个野生型克隆和分别携带 4 种非 stop 突变（Stop>Glycine 或 *>G，Stop>Leucine 或 *>L，Stop>Arginine 或 *>R，Stop>Serine 或 *>S）的克隆。分析发现，非 stop 突变型 BAP1 mRNA 水平与野生型克隆无显著差异，但非 stop 突变蛋白几乎检测不到。BAP1 蛋白是多梳抑制复合物的水解酶成分，能催化组蛋白 H2A 赖氨酸 - 119（K119）位点的泛素去除，突变细胞系中 BAP1 蛋白缺失导致 H2A-K119 泛素化水平显著升高。

为探究 BAP1 蛋白缺失是否因降解，研究人员用蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bort.）、MG132 和内溶酶体途径抑制剂氯喹（Chlor.）、巴氟霉素 A1（BafA1）处理细胞，结果显示抑制这两条途径都无法挽救突变型 BAP1 蛋白的缺失。此外，用一系列蛋白酶抑制剂处理，包括蛋白酶抑制剂鸡尾酒、苯甲基磺酰氟等，以及联合使用蛋白酶体和内溶酶体途径抑制剂（硼替佐米 + 巴氟霉素 A1），都不能恢复非 stop 突变型 BAP1 蛋白的表达，说明其蛋白缺失不是因为降解。

研究人员推测翻译调控可能导致 BAP1 蛋白表达下降。BAP1 基因 3’UTR 下游有一个框内第二个开放阅读框（ORF），编码预测的 162 个氨基酸的 HUCEP13 蛋白。为验证其对 BAP1 蛋白翻译的影响，研究人员构建表达载体突变 HUCEP13 ORF 的起始密码子或删除其 KOZAK 序列，还对内源的 HUCEP13 基因起始密码子进行突变，结果都表明 HUCEP13 的存在不影响 BAP1 蛋白的翻译。另外，敲低核糖体相关质量控制蛋白，如内皮分化相关因子 1（EDF1）、真核翻译起始因子 4E 家族成员 2（EIF4E2，又名 4EHP）等，也对非 stop 突变型 BAP1 蛋白表达水平无影响。通过半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析，也未发现非 stop 突变对 BAP1 基因终止密码子周围隐蔽剪接位点有影响。

利用兔网织红细胞体外转录 - 翻译系统研究发现，4 种非 stop 突变型 BAP1 开放阅读框的翻译能力比含正常终止密码子的野生型 ORF 显著降低。通过蔗糖梯度进行多聚核糖体分析，分离野生型和非 stop 突变型 HEK293 细胞的不同翻译复合物，定量分析 BAP1 mRNA 和对照 mRNA（亲环蛋白 A，PPIA）的分布，发现非 stop 突变细胞系中 BAP1 mRNA 在重多聚核糖体组分中显著减少，而对照 PPIA mRNA 无此现象，说明非 stop 突变细胞系中 BAP1 蛋白缺失与突变 mRNA 有效翻译大幅减少有关。
3. VHL 的非 stop 突变导致肿瘤抑制蛋白经蛋白酶体降解：使用 CRISPR-Cas12 系统对 HEK293 细胞 VHL 基因座进行精准编辑引入非 stop 突变，以一个亲本野生型和一个克隆野生型细胞为对照，对 3 种非 stop 突变（Stop>Cysteine 或 *>C，Stop>Tryptophan 或 *>W，Stop>Leucine 或 *>L）的两个克隆进行分析。结果显示，非 stop 突变不影响 VHL mRNA 水平，但导致非 stop 突变型 VHL 蛋白几乎完全缺失。

VHL 蛋白参与缺氧诱导因子 α 亚基（HIF-αs）的泛素化和降解过程，HIF-αs 是一类转录因子，在基因表达响应氧气水平变化中起核心作用。在非 stop 突变细胞系中，VHL 蛋白缺失使转录因子 HIF-1α 蛋白丰度增加，同时 HIF-1α 的许多靶基因，如血管内皮生长因子 A（VEGFA）、血管内皮生长因子 C（VEGFC）、Fms 相关受体酪氨酸激酶 1（FLT-1）等的 mRNA 水平升高，验证了非 stop 突变细胞中 VHL 活性丧失。在细胞水平上，非 stop 突变细胞系迁移能力增强，长期集落形成和短期增殖能力未受影响，与之前观察到的 VHL 缺失细胞表型相符。通过实验排除了蛋白缺失是因为聚集的可能性。

用蛋白酶体抑制剂硼替佐米、MG132 和内溶酶体途径抑制剂氯喹、巴氟霉素 A1 处理 VHL 野生型和非 stop 突变细胞，发现抑制蛋白酶体途径可显著挽救非 stop 突变型 VHL 蛋白的丰度。通过环己酰亚胺（CHX）追踪实验评估蛋白稳定性，发现野生型 VHL 蛋白半衰期约 20 小时，而非 stop 突变型 VHL 蛋白半衰期仅约 4.5 小时，说明 VHL 的非 stop 突变导致蛋白稳定性下降，通过泛素 - 蛋白酶体途径快速降解，进而增加 HIF-1α 信号传导和细胞迁移能力。研究还发现，非 stop 突变型 VHL 蛋白 C 末端氨基酸疏水性增加，而 BAP1 非 stop 蛋白 C 末端未出现这种情况，这解释了两者蛋白缺失机制的差异。
4. VHL 终止密码子突变导致翻译起始位点选择改变：在蛋白酶体抑制剂存在的情况下，研究人员发现非 stop 突变对 VHL 不同蛋白亚型的丰度有差异影响。VHL 基因编码两种主要蛋白亚型，VHL²¹³和 VHL¹⁶⁰，VHL²¹³由 213 个氨基酸组成，VHL¹⁶⁰是从开放阅读框第 54 位密码子起始翻译产生的，缺少前 53 个氨基酸，这两种亚型对 VHL 基因的肿瘤抑制作用都很重要。还有一种亚型 VHL¹⁷²，由可变剪接产生，缺少第二个外显子，不具有肿瘤抑制功能。实验发现，VHL²¹³亚型水平不变，VHL¹⁷²剪接亚型在 RNA 水平有所降低，但在不同非 stop 突变克隆中变化不一致。

使用硼替佐米挽救非 stop 突变型 VHL 蛋白后，发现 VHL²¹³和 VHL¹⁶⁰两种蛋白亚型的数量发生显著变化，突变体中 VHL²¹³的量比野生型明显更高。研究人员推测 VHL 终止密码子突变可能影响 mRNA 上相关因子的组成，从而改变起始密码子的选择。通过 RNA 亲和纯化结合质谱（RAP-MS）技术，从野生型和非 stop 突变型细胞系中拉下 VHL mRNA 及其结合蛋白复合物并鉴定，筛选出 63 种符合条件的蛋白。利用 RBP2GO 数据库的 RBP2GO 分数进一步筛选出 12 种可能与起始位点选择相关的蛋白，包括丝氨酸和精氨酸丰富的剪接因子 6（SRSF6）、真核翻译起始因子 4A1（EIF4A1）等。

用 siPOOLs 对这 12 个基因进行敲低实验，评估其对 VHL 亚型分布的影响，发现敲低 EIF4A1、EIF3D、RPS3 后，VHL²¹³/VHL¹⁶⁰比值显著增加，即促进了非 stop 突变型 VHL mRNA 第一个起始位点的选择；敲低 EIF4G2、SRSF6、PABPC1 和 RPL23A 也有一定影响，但不显著。通过 STRING 网络分析发现这些蛋白主要参与翻译起始、核糖体和剪接相关复合物和功能。进一步验证发现，翻译起始因子 EIF4A1、EIF3D、EIF4G2 和聚 A 结合蛋白 PABPC1 在调节非 stop 突变型 VHL 细胞的起始位点选择中起重要作用。而敲低其他 13 种已知的翻译起始密码子选择因子、核糖体循环因子、翻译终止因子和终止密码子结合起始因子，未观察到起始位点选择的显著变化。
5. VHL 生殖系非 stop 突变与患者严重疾病表型相关：VHL 综合征患者会在一生中患多种肿瘤，通常是从患病父母遗传一个 VHL 基因生殖系突变，从未患病父母遗传一个野生型基因。肿瘤形成是因为正常等位基因发生体细胞失活。此前研究多关注 VHL 基因的缺失、错义、无义突变，在弗莱堡 VHL 登记处，研究人员发现 4 名患者携带 VHL 生殖系非 stop 突变。

观察数据显示，VHL 综合征患者肿瘤发病更频繁且年龄更小。携带 VHL 非 stop Ter214Gly（*>G）突变的患者，在 40 岁前都出现了严重疾病表现，疾病外显率达 100%，有一名患者 15 岁就发病，其疾病外显率和发病年龄与已知致病性 Arg167Trp 突变携带者相当。磁共振成像诊断出患者患有透明细胞肾细胞癌（ccRCC）、嗜铬细胞瘤等，证实了 VHL 非 stop 突变的临床相关性。

通过更多病例报告进一步验证了 VHL 生殖系非 stop 突变的重要性，包括 *>L 和 *>R 突变。在 HEK293 细胞中引入 *>G 和 *>R 突变构建细胞系，发现非 stop 突变细胞中 VHL 蛋白表达明显降低，HIF-1α 蛋白水平升高，且非 stop 突变型 VHL 蛋白可被硼替佐米挽救，同时突变细胞中 VHL²¹³水平选择性增加，表明翻译起始位点选择发生改变，与体细胞非 stop 突变的结果相似。

综上，本研究发现非 stop 突变导致肾癌抑制蛋白 VHL 和 BAP1 显著减少，且机制不同，VHL 经蛋白酶体降解，BAP1 翻译受抑制，VHL 还存在翻译起始位点选择改变，同时 VHL 生殖系非 stop 突变与 VHL 综合征患者的严重疾病表型相关。

讨论

癌症中非 stop 延伸突变的功能影响大多还未被探究。NonStopDB 基于 COSMIC 数据库的泛癌分析发现了 3412 个非 stop 突变，SMAD4 肿瘤抑制基因的非 stop 突变会导致蛋白缺失和肿瘤发生表型增加，主要出现在胰腺癌和结肠癌中。人类基因突变数据库（HGMD）的荟萃分析显示，87 个已知导致人类遗传疾病的基因中有 119 个非 stop 突变，这些都凸显了非 stop 突变在疾病进展中的潜在影响。因此，研究非 stop 突变对肿瘤发生、发展和治疗反应的影响很有必要，有助于制定个性化治疗方案、揭示基因调控机制和为遗传性癌症综合征提供策略。

本研究假设那些既频繁出现非 stop 突变，又常受其他点突变影响的癌症基因可能在肿瘤中具有致病作用。分析发现 VHL 和 BAP1 肿瘤抑制基因在肾癌患者中频繁出现非 stop 突变，TCGA 的突变谱分析表明它们是肾癌发病机制中的关键驱动基因。

BAP1 的 stop-loss 突变导致 C 末端延长 205 个氨基酸，使 BAP1 蛋白缺失，组蛋白 H2A-K119 泛素化水平升高。其蛋白缺失与 mRNA 水平降低和蛋白降解无关，3’UTR 下游第二个 ORF（编码 HUCEP13）的翻译也不影响非 stop 突变型 BAP1 蛋白表达。体外转录 - 翻译实验和多聚核糖体分析表明，非 stop 突变型 BAP1 mRNA 翻译减少，可能是因为翻译起始或延伸效率降低、核糖体停滞。

VHL 的非 stop 突变使 C 末端延长 14 个氨基酸，疏水性增加，导致蛋白经泛素 - 蛋白酶体途径快速降解，这与 SMAD4 的情况类似，也符合翻译延伸到 3’UTR 常导致蛋白表达下降，且富含疏水残基的延伸会被蛋白酶体降解的规律。VHL 失活会导致多种癌症，尤其是 ccRCC，本研究中 VHL 非 stop 突变导致蛋白缺失，HIF1A 水平及其下游转录靶标增加，细胞迁移能力增强，体现了 VHL 功能在分子和细胞水平的丧失。

携带 VHL 生殖系失活突变的患者会患 VHL 综合征，有更高的肿瘤发生风险。除了 NonStopDB 中列出的癌症体细胞突变，弗莱堡 VHL 登记处的 4 名携带生殖系 *>G 突变的患者，以及另外两名携带 *>L 和 *>R 突变的患者，都患有 VHL 综合征，且发病早、肿瘤发生率高，证实了 VHL 非 stop 突变的影响。

非 stop 通读突变（没有第二个框内终止密码子的非 stop 突变）可通过无终止降解途径导致 mRNA 降解或抑制蛋白质翻译。本研究中 BAP1 的非 stop 突变抑制翻译，VHL 的非 stop 突变除了导致蛋白降解，还改变了翻译起始位点选择，影响蛋白亚型的数量。RNA 亲和纯化结合质谱分析确定了野生型和非 stop 突变型 VHL mRNA 上差异结合的 RNA 结合蛋白，验证实验表明翻译起始因子 EIF4A1、EIF3D、EIF4G2 和聚 A 结合蛋白 PABPC1 在调节非 stop 突变型 VHL 起始位点选择中起作用。这些蛋白相互作用，可能通过调节翻译起始和终止之间的相互作用来影响 VHL 起始密码子的选择，进而产生不同的 VHL 亚型。

总之，本研究确定肾癌抑制基因 VHL 和 BAP1 存在复发性体细胞非 stop 突变，它们通过不同机制导致蛋白大量缺失，还揭示了非 stop 突变在翻译多个阶段调节蛋白表达的新机制，VHL 生殖系非 stop 突变与严重疾病表型的关联也凸显了研究非 stop 突变的重要性。

材料和方法

1. 细胞培养：野生型和非 stop 突变型 HEK293 细胞系在添加 10% 胎牛血清的 Iscove 改良杜氏培养基（IMDM）中培养，培养条件为 37°C、5% CO₂的湿润培养箱。细胞定期进行指纹鉴定和支原体检测。
2. CRISPR-Cas 介导的精准基因编辑和克隆筛选：根据 IDT 协议设计针对 VHL 和 BAP1 终止密码子突变的向导 RNA（gRNAs），获取 gRNAs 和单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）。对 HEK293 细胞进行核转染，分别使用 CRISPR-Cas12（用于 VHL）和 CRISPR