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宫颈癌（CCa）严重威胁全球女性健康，早期诊断和治疗至关重要。本文通过多数据库分析及实验验证，发现 F2RL1 在 CCa 组织中高表达，与患者生存率相关，还与免疫浸润有关，有望成为 CCa 早期诊断和预后预测的生物标志物。
引言
宫颈癌（CCa）是全球女性健康的重大威胁，是女性第四大常见癌症。2018 年，全球有 57 万新发病例，超 31.1 万人死亡。尽管有预防疫苗和早期筛查方法，但其发病率和死亡率仍居高不下，现有治疗手段存在副作用大、晚期疗效差等问题，因此深入研究其分子机制，寻找更有效的诊断和治疗方法迫在眉睫。
F2R 样胰蛋白酶受体 1（F2RL1），又称蛋白酶激活受体 2（PAR2），是一种 G 蛋白偶联受体，参与炎症、疼痛感知和癌症进展等多种细胞功能。它可被多种蛋白酶激活，在多种癌症组织和细胞中高表达，与肿瘤生长、侵袭和转移相关。然而，其在宫颈癌中的作用尚不清楚。本研究旨在探索 F2RL1 作为宫颈癌预后指标和治疗靶点的潜力，为宫颈癌的发病机制研究和个性化治疗提供新视角。
材料与方法
- RNA 测序数据和生物信息学分析：从 TCGA 数据库获取 RNA 测序数据，经 STAR 流程处理后以 TPM 格式提取基因表达和临床信息。使用 R 软件进行数据处理、可视化和统计分析，遵循相关伦理和出版指南。
- 差异表达 mRNA 分析：对数据进行标准化和对数转换，使用‘limma’包筛选差异表达 mRNA（DEmRNAs），设定 | logFC|＞1.5 且 P.adj＜0.05 为标准，通过火山图和热图展示结果。F2RL1 的免疫组化染色数据来自 HPA 数据库。
- 生存和 ROC 分析：利用 “Survival” 包分析 DEmRNAs 与患者预后的关系，根据 DEmRNAs 的中位表达水平将患者分为高、低表达组，使用 Kaplan - Meier Plotter 生成生存曲线。借助 “pROC” 包，利用仙桃（XIANGTAO）数据进行 ROC 分析。
- 与免疫相关的靶基因鉴定：通过 ImmPort 数据库鉴定免疫相关基因，利用 Venn 图找出与预后相关的 DEmRNAs 和免疫相关基因的交集，确定 F2RL1 为靶基因。运用 STRING 数据库和 Cytoscape 的 cytohubba 插件构建 PPI 网络并筛选枢纽基因。
- GO、KEGG 和 GSEA 功能富集分析：运用 Gene Ontology（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因集富集分析（GSEA）研究 F2RL1 的功能。使用 “clusterProfiler” 包进行 GO 和 KEGG 术语分析，依据 F2RL1 的中位表达水平将患者分组，用 GSEA（v4.2.3）进行分析，以 P＜0.05 且 FDR＜0.25 为有统计学意义。
- F2RL1 的免疫相关分析：利用 R 包 GSVA 中的 ssGSEA 算法，基于 TIMER2.0 的云数据计算 24 种免疫细胞的免疫浸润。通过 Spearman 分析评估 F2RL1 表达与免疫细胞、免疫检查点阻断（ICB）标记物的相关性，使用 “ggplot2” 和 “pheatmap” 包可视化。用 Wilcoxon 秩和检验评估高低 F2RL1 表达患者的免疫浸润细胞富集情况。
- 宫颈刮片和血清的收集：收集宫颈刮片用于 HPV 和 TCT 检测，根据检测结果将参与者分组，对照组为健康女性的宫颈刮片。所有参与者均签署知情同意书，研究遵循赫尔辛基宣言，经山东省第三医院伦理委员会批准。
- RT - qPCR：用 Total RNA Extraction Reagent 提取宫颈刮片中的 mRNA，使用 Strand cDNA Synthesis Kit 进行逆转录，在 Applied Biosystems? 7500 上用 PCR SYBR Green Master Mix 进行 Q - PCR 实验，使用特定引物扩增 F2RL1 和 β - actin。
- Western blot：将 15 微克可溶性蛋白上样到 20% 预制 BIS - Tris 凝胶，电泳分离后转移到聚偏二氟乙烯膜上，依次用抗 F2RL1 和抗 Tubulin 等一抗及 HRP 标记的二抗处理，用 Bio - Rad 成像密度计定量蛋白水平，实验重复三次。
- ELISA：用 Human F2RL1 Assay Kit 检测各组血清中 F2RL1 的水平，在 450nm 处测量吸光度，重复三次。
- 统计分析：用 SPSS 23.0 软件，通过 Kruskal - Wallis 检验分析正常和 CCa 组织中 F2RL1 的水平，利用卡方检验和多变量 COX 回归分析 F2RL1 表达与临床病理因素的关系，P＜0.05 为有统计学意义。
结果
- F2RL1 在 CCa 和正常组织中的差异表达：通过分析 TCGA 和 GTEx 数据库中的 33 种癌症类型，发现 F2RL1 在 27 种癌症（包括 CCa）中的表达存在显著差异。在 GSE63678 数据集验证了这一结果，F2RL1 在 CCa 组织中上调，在鳞状细胞癌和腺癌亚型中表达不同，且在不同病理阶段表达也有差异，免疫组化分析进一步证实了这些发现。
- F2RL1 在 CCa 患者生存、预后和诊断中的作用：生存分析显示，高 F2RL1 表达的 CCa 患者总生存期（OS）、无进展生存期（PFS）和无进展间隔期（PFI）较低。COX 回归分析表明，F2RL1 表达在 N 分期（N0，N1）和不同组织学类型间存在显著差异，鳞状细胞癌的表达水平高于腺癌和腺鳞癌。ROC 曲线显示 F2RL1 具有良好的诊断价值（AUC = 0.966），在不同种族和病理类型中也有诊断意义。
- F2RL1 与免疫相关基因的关系：从 ImmPort 数据库获取 457 个免疫相关基因，通过 Venn 分析找到 43 个与 CCa 患者预后相关的 DEmRNAs 重叠的靶基因。构建 F2RL1 与这些基因的相互作用网络，确定了一些枢纽基因。功能富集分析表明，F2RL1 与多种分子功能、细胞成分和生物过程相关，KEGG 分析显示其与神经活性配体 - 受体相互作用、胆汁分泌等通路共富集。
- F2RL1 与免疫浸润的关系：研究发现 F2RL1 表达与大多数免疫细胞浸润呈负相关，尤其是 TFH 细胞和细胞毒性细胞。同时，F2RL1 与多种免疫检查点（如 PD - 1、PD - L1 等）呈负相关。进一步分析发现，高 F2RL1 表达的 CCa 患者免疫细胞亚群浓度较低。Kaplan - Meier Plotter 分析显示，不同免疫细胞富集或减少条件下，高低 F2RL1 表达组的生存曲线存在显著差异。
- F2RL1 在早期宫颈癌发生中的表达实验验证：对血清标本和宫颈脱落细胞进行检测，WB、RT - qPCR 和 ELISA 实验结果表明，在 ASCAS、高危 HPV 组、CIN - I/CIN - II/CIN - III 和原位癌组中，F2RL1 的表达与对照组相比有显著差异，提示可通过检测血清和宫颈样本中的 F2RL1 进行早期宫颈癌诊断。
讨论
F2RL1 在多种肿瘤中均有表达，其功能通过 PLC、MAPK 等多种信号通路介导。TCGA 数据库显示 F2RL1 在 CCa 和正常组织中的表达不同，免疫组化结果表明其在不同组织学亚型的 CCa 中表达高于正常组织，且在宫颈原位癌组中表达也显著升高。
生存分析表明高 F2RL1 表达的 CCa 患者 OS、PFS 和 PFI 较低，COX 回归分析和 ROC 曲线进一步证实了 F2RL1 在 CCa 预后和诊断中的重要性。通过生物信息学分析和实验验证发现，F2RL1 在宫颈上皮细胞的 ASCUS 阶段开始快速升高，在 HPV 感染和 CIN I 阶段达到峰值，提示其可能作为早期宫颈癌的生物标志物。
对 F2RL1 相关基因的研究发现，其与免疫调节相互作用通路有关，F2RL1 在正常免疫过程中对免疫细胞功能有重要调节作用，但在 CCa 中这一机制可能受损。免疫浸润分析表明 F2RL1 与多数免疫细胞浸润呈负相关，可能影响肿瘤免疫逃逸。此外，F2RL1 与免疫检查点的负相关关系提示其可能促进免疫细胞激活。
血清和宫颈刮片检测结果显示 F2RL1 在早期宫颈癌诊断方面有潜力，有望成为 HPV 和 TCT 检测的补充或替代方法。然而，本研究存在一定局限性，如可能存在样本偏差、样本量需扩大以及需要更多体外和体内实验验证 F2RL1 的生物学功能。
结论
本研究利用多个公共数据库及实验技术，首次揭示了 F2RL1 在 CCa 中的预后和早期诊断意义，以及其与免疫浸润的相关性。F2RL1 与宫颈癌的发展密切相关，有潜力作为预测 CCa 患者预后的生物标志物，但仍需更多实验验证其对 CCa 的生物学影响和潜在机制。
