VARP 与 SNX27 的神秘 “牵手”：解锁内体超复合物形成及货物分选的新密码

本文通过生化、生物物理等实验，揭示 VARP 能结合 SNX27 促进内体超复合物形成。研究发现不同内体包被蛋白组合对膜重塑和货物分选的影响，为理解细胞内物质运输机制提供依据，也为相关疾病治疗研究开辟新思路。

　　

研究背景

细胞内的运输通路对于维持细胞正常功能至关重要，其中内体作为关键枢纽，在蛋白质货物分选过程中发挥着核心作用。Retromer（VPS26/VPS35/VPS29）是内体膜上参与货物分选的重要复合物，它可与多种分选衔接蛋白（sorting nexin，SNX）相互作用，形成不同的内体包被复合物，介导货物的运输。在酵母中，Retromer 以稳定的五聚体形式存在，由 Vps26/Vps35/Vps29 异源三聚体与 Vps5 和 Vps17 组成的 SNX 异源二聚体构成。而在多细胞动物（metazoans）中，Retromer 的作用更为复杂，它能够与更多种类的 SNX 蛋白相互作用，包括 SNX1/SNX5、SNX2/SNX6 等 SNX - BAR 异源二聚体、SNX3 以及多细胞动物特有的 SNX27。这些相互作用的异常与多种人类神经疾病相关，如阿尔茨海默病、帕金森病和唐氏综合征等。

SNX 蛋白家族成员众多，其特征是含有一个 PX（Phox Homology）结构域，可识别富含磷酸肌醇的膜。部分 SNX 蛋白可作为货物适配器，将关键蛋白从内体运输到质膜或反式高尔基体（trans - Golgi complex）；还有部分成员能够使膜发生变形，例如 SNX1 和 SNX2 中的 BAR（Bin/Amphiphysin/Rvs）结构域可通过形成同源二聚体，利用支架机制或插入两亲性螺旋来驱动或稳定膜曲率。在哺乳动物中，Retromer 被认为与特定的 SNX - BAR 异源二聚体结合，将货物从内体回收至反式高尔基体网络（trans - Golgi network），这一过程类似于酵母中的五聚体途径。此外，SNX1/SNX5 或 SNX2/SNX6 异源二聚体还可形成内体 SNX - BAR 分选复合物（Endosomal SNX - BAR Sorting Complex for Promoting Exit 1，ESCPE - 1），参与货物的分选和运输。

在众多与 Retromer 相互作用的蛋白中，VARP（VPS9 domain ankyrin repeat protein，也称为 ANKRD27）逐渐成为调节晚期内体动力学的关键角色。VARP 是一种多结构域蛋白，包含 VPS9 结构域和两个锚蛋白重复结构域，可作为 Rab32/38 效应子，并对 Rab21 具有鸟嘌呤核苷酸交换因子活性。此前研究发现 VARP 可能与 SNX27 相互作用，但二者直接结合的生化基础尚未明确。本研究旨在深入探究 VARP 与 SNX27 的相互作用及其在内体包被组装和货物分选中的作用机制。

VARP 直接与 SNX27 在体外结合

过去的研究表明，VARP 有众多的蛋白结合伙伴，在 Retromer 介导的内体运输途径中发挥着多样的作用。同时，通过蛋白质组学方法对 SNX27 的相互作用组进行探索，发现 VARP 和 SNX27 可能直接相互结合。为验证这一假设，研究人员进行了一系列实验。

研究人员利用重组纯化蛋白进行下拉实验（pull - down experiments）。将谷胱甘肽 S - 转移酶（glutathione S - transferase，GST）标记的全长 SNX27（GST - SNX27）作为诱饵，C 末端带有 10×His 标签的全长 VARP（VARP - H10）作为猎物。实验结果显示，GST - SNX27 能够有效下拉 VARP - H10，在考马斯亮蓝染色凝胶上可检测到该相互作用，并通过抗 10×His 标签抗体进行了验证。

为进一步量化 VARP FL 和 SNX27 蛋白之间的相互作用，研究人员采用了生物层干涉技术（biolayer interferometry，BLI）。实验观察到 SNX27 和 VARP 之间的结合呈现出明显的剂量依赖性增加，计算得出的平均结合亲和力（解离常数Kd）为亚微摩尔级（0.34 ± 0.01 μM），且二者结合的化学计量比为 1:1。作为阳性对照，研究人员还测量了 VARP FL 与 Retromer 的结合亲和力，结果显示其Kd为 0.07 ± 0.01 μM，化学计量比为 1:2，这与已发表的数据相符。

VARP 的折叠 N 末端结构域直接结合 SNX27 的 PDZ 结构域

为深入了解 SNX27 和 VARP 相互作用的分子机制，研究人员借助 AlphaFold Multimer version 2.3（AF2.3）进行计算建模。AF2.3 模型表明，VARP 的 N 末端球状结构域（N - VARP）能够特异性地与 SNX27 的 PDZ（postsynaptic density 95/discs large/zonula occludens - 1）结构域结合。通过仅对 VARP N 末端和 SNX27 PDZ 结构域进行建模，得到了高度可重复的模型，其预测局部差异距离测试（predicted local difference distance test，pLDDT）分数接近 90，界面预测模板建模（interface predicted template modeling，ipTM）分数接近 0.9，预测对齐误差（predicted aligned error，PAE）分数接近 0。这些指标有力地支持了 SNX27 PDZ 结构域和 N - VARP 之间存在结合界面。

随后，研究人员利用 GST 下拉实验对 AF2.3 模型进行验证。实验结果与模型预测一致，N - VARP 能够下拉全长 SNX27 和 SNX27 的 PDZ 结构域，而与 SNX27 的 PX 和 FERM 结构域单独作用时，未检测到明显结合。BLI 实验进一步量化了这种相互作用，发现 N - VARP 与全长 SNX27 或 PDZ 结构域结合时，Kd值非常相似，再次表明 PDZ 结构域介导了二者的相互作用。

通过对 AF2.3 模型的结构分析，研究人员发现 N - VARP 中的一段短序列（残基 95 至 101；序列：LFEETFY）与 SNX27 的保守 PDZbm 口袋结合，且该序列与经典的 I 型 PDZbm 序列具有相似性。基于此，研究人员引入了基于结构的点突变，对 VARP N 末端的特定残基进行突变。结果显示，VARP T99A 突变体和 F96A/E98A/F100A 三突变体与 SNX27 的结合无法检测到，而 E98A 和 F96A/F100A 突变体与野生型 N - VARP 相比，结合能力有所降低。这表明 VARP Thr⁹⁹在 VARP 和 SNX27 复合物的形成中起核心作用，而 VARP 残基 Glu⁹⁸、Phe⁹⁶和 Phe¹⁰⁰在与 SNX27 建立接触中起重要辅助作用。

SNX27/Retromer 使富含 PI (3) P 脂质和 PDZbm 货物的膜形成小管

在明确 VARP 与 SNX27 的相互作用后，研究人员进一步探究 VARP 在内体包被蛋白组装到膜上过程中的作用，确定 Retromer、SNXs 和 VARP 的哪些组合能够在体外结合并使膜形成小管。研究人员开发了一种生化重构系统，利用纯化的哺乳动物重组蛋白、货物基序（CI - MPR 或 PDZbm）以及含有模拟生理组成脂质头部基团的脂质体（Folch I 和 PI (3) P）进行实验。通过脂质体沉淀实验和负染电子显微镜（negative - stain electron microscopy，EM）观察，研究人员分析了不同组合的蛋白与膜的结合情况以及小管的形成和形态。

SNX27/Retromer 被广泛认为是一种内体蛋白包被，但此前其结合膜并产生小管的能力尚未得到直接证实。研究人员首先对 SNX27/Retromer 单独作用时的情况进行研究。脂质体沉淀实验表明，SNX27 能够特异性地被招募到富含 PI (3) P 的脂质体上，而对富含 Folch I 的脂质体则无明显结合。Retromer 需要通过 SNX27 的招募才能结合 PI (3) P 膜，并且 PDZbm 货物的存在能够正向影响 SNX27 和 Retromer 的膜招募。负染 EM 结果显示，SNX27 单独或与 Retromer 一起，都能够驱动富含 PI (3) P 和 PDZbm 货物的脂质体形成小管，但二者形成的小管直径存在明显差异。SNX27 形成的小管平均直径为 38.0 ± 5.0 nm，而 SNX27/Retromer 包被产生的小管平均直径为 80 ± 6.0 nm。这表明 SNX27 和 Retromer 能够协同作用重塑膜结构，Retromer 的存在使小管直径显著增大。

SNX2/SNX6 使展示 CI - MPR 货物的 Folch I 膜形成小管

在明确 SNX27/Retromer 的作用后，研究人员对另一个重要的内体包被蛋白复合物 SNX2/SNX6（即 ESCPE - 1）进行研究，以确定它与 SNX27/Retromer 在结合和使膜形成小管能力上的差异。

研究人员重构了哺乳动物 SNX2/SNX6 异源二聚体，实验发现 SNX2/SNX6 能够特异性地结合富含 Folch I 的脂质体，对 PI (3) P 脂质体则无明显结合。负染 EM 显示，SNX2/SNX6 能够诱导 Folch I 脂质体形成膜小管，平均小管直径为 55.0 ± 6.0 nm。当在 SNX2/SNX6 和 Folch I 脂质体混合物中加入 CI - MPR 货物时，膜结合增强，形成的小管平均直径为 53.0 ± 5.0 nm，且小管的 “运行长度” 增加了约两到三倍，这突出了 CI - MPR 货物对 SNX2/SNX6 小管形成的重要影响。

生化重构方法揭示 SNX2/SNX6 和 SNX27/Retromer 形成具有不同小管直径的独特亚复合物

研究人员通过脂质体沉淀实验和负染 EM 进一步评估 SNX2/SNX6、SNX27 和 Retromer 的不同组合对膜结合和小管形成的影响。实验结果显示，SNX2/SNX6 在富含 Folch I 的膜上，无论是存在 CI - MPR 货物还是 PDZbm 货物，都无法招募 Retromer，这表明 SNX2/SNX6 对 Folch I 膜具有特异性，可能作为独立的包被发挥作用。

在对不同亚复合物对小管形态影响的研究中，研究人员发现，当 Retromer 与 SNX2/SNX6 在富含 Folch I 和 CI - MPR 货物的情况下结合时，小管形成效率显著降低。此外，研究人员还试图确定 SNX2/SNX6、SNX27 和 Retromer 是否能在货物和磷脂存在的情况下形成内体超复合物。尽管此前研究表明 SNX/BAR 家族成员的 N 末端延伸可与 SNX27 的 FERM 模块结合，但在本研究的重构实验中，在富含 Folch I 的脂质体上，无论存在何种货物，都无法检测到 SNX27 或 SNX27/Retromer 与 SNX2/SNX6 的有效沉淀。在富含 PI (3) P 的膜上，SNX27 和 SNX27/Retromer 表现出特异性结合，而未检测到 SNX2/SNX6 的结合。

综合这些数据，研究人员发现 SNX2/SNX6 和 SNX27/Retromer 结合的膜具有不同的组成，磷脂是驱动蛋白招募的主要因素。同时，通过对负染 EM 图像的分析，研究人员发现不同组合形成的小管直径存在差异，进一步表明这些小管可能主要由不同的复合物装饰。

VARP 是在膜上重构拟议的内体超复合物所必需的

由于 SNX2/SNX6 无法招募 SNX27/Retromer 到脂质体膜上，研究人员推测可能存在一种未知蛋白促进内体亚复合物之间的结合。鉴于此前发现的 VARP N 末端与 SNX27 的相互作用，研究人员在生化重构实验中加入 VARP 进行测试。

研究人员在富含 PI (3) P 的脂质体和 PDZbm 货物存在的情况下进行沉淀实验，结果显示加入 VARP 后，在脂质体膜上形成了近似化学计量比的 SNX2/SNX6 和 Retromer 复合物，SNX27 在该复合物中的丰度略高，而 VARP 本身的化学计量比则较低。这一结果与之前的生物物理数据和已发表的数据一致，即一个 VARP 可通过 VPS29 亚基结合两个 Retromer 复合物。

为进一步验证内体超复合物蛋白在细胞内的相互作用，研究人员在过表达 VARP - GFP 的人胚肾 293 细胞系（Expi293）中进行了共免疫沉淀实验。结果表明，在 VARP 存在的情况下，内体超复合物能够有效组装。通过对含有全套内体蛋白（SNX27、Retromer、SNX2/SNX6 和 VARP）的脂质体进行负染 EM 观察，发现形成的小管平均直径为 69 ± 3.5 nm，介于 SNX27/Retromer 和 SNX2/SNX6 复合物形成的小管直径之间，这表明 VARP 的加入可能改变了包被晶格的组织方式。

研究人员还对 N - VARP 单独促进内体超复合物组装的能力进行了测试。通过引入基于结构的 N - VARP 突变体进行脂质体沉淀实验，发现突变体无法重构出正常的超复合物。同时，竞争实验表明，N - VARP 与 PDZbm 货物基序结合在 SNX27 PDZ 结构域的同一位置，但 N - VARP 的存在并不妨碍货物的结合和内体超复合物对膜的招募。此外，研究人员还发现，在无货物的情况下，N - VARP 在 PI (3) P 膜上的沉淀增强，且 PDZbm 货物是通过与 SNX27 的结合存在于复合物中的。

讨论

细胞内的运输通路依赖于多种蛋白质成分之间的相互作用，以促进跨膜蛋白货物的分选和运输。内体系统尤为复杂，多个蛋白质在时空上相互作用，将货物分选到不同的目的地。本研究旨在阐明特定 SNX 蛋白（SNX2、SNX6 和 SNX27）与 Retromer 复合物之间的相互作用如何影响包被形成和膜小管形态，同时探究 VARP 如何通过与 SNX27 的 PDZ 结构域直接相互作用，促进由 SNX27/Retromer 和 ESCPE - 1 组成的内体超复合物的形成。

研究人员确定了 VARP N 末端与 SNX27 PDZ 结构域直接结合的生化和生物学作用。通过 AF2.3 计算建模和突变研究，明确了 VARP 和 SNX27 PDZ 上促进结合的关键残基。尽管尝试结晶 VARP N 末端未成功，但 AF2.3 预测其 N 末端（残基 1 至 117）构成一个小的折叠球状结构域，且通过特定序列与 SNX27 的 PDZ 口袋结合，其结合模式与经典的 I 型 PDZbm 序列相似。

利用脂质体沉淀实验和负染 EM 分析，研究人员证实 SNX27 具有内在的膜变形能力，能够诱导富含 PI (3) P 的脂质体形成小管，加入 Retromer 后小管直径显著增大，这表明二者协同重塑膜结构。同时，研究发现磷脂组成和货物的存在影响 SNX27/Retromer 的膜招募，且 SNX27 对 PI (3) P 膜具有明显的偏好性。此外，SNX27 单独变形膜的能力出乎意料，这表明 Retromer 结合的 SNX 蛋白具有多种不同的结合和塑造内体膜的机制。

以 SNX2/SNX6 异源二聚体代表 ESCPE - 1 进行研究，发现 ESCPE - 1 能够强烈结合富含 Folch I 的膜，但不招募 Retromer。这一结果表明，哺乳动物的 SNX - BAR/Retromer 系统可能与酵母中的有所不同，不同的 ESCPE - 1 复合物可能识别具有不同磷脂组成的膜，以确保在动态的内体膜脂质周转条件下捕获货物。同时，ESCPE - 1 形成的小管直径与 SNX27 或 SNX27/Retromer 形成的小管直径不同，且 CI - MPR 货物能够增强 ESCPE - 1 的膜结合和小管形成能力。

通过生化重构系统，研究人员发现 VARP 是内体超复合物形成的关键组件。加入 VARP 后，能够在膜上观察到所有组件之间的强烈生化相互作用，且形成的超复合物产生的小管直径与 SNX27/Retromer 单独形成的小管直径不同，这表明 VARP 可能通过改变包被组成或结构来调节包被组装。此外，虽然 VARP 的 N 末端与货物竞争结合 SNX27 的 PDZ 结构域，但实验数据表明 VARP 并不妨碍货物结合，甚至可能促进 SNX27 的构象变化，使其既能结合货物又能与其他蛋白相互作用。

本研究结合生化重构系统、计算建模和定量生物物理方法，为测试多种内体蛋白如何协同作用产生小管提供了有力工具，有助于深入理解细胞如何<