细胞壁果胶缺陷影响植物生长：RG-II 二聚化与激素调控的新关联

本文聚焦拟南芥 mur1 突变体，揭示细胞壁关键成分 RG-II 果胶二聚化受损，通过影响生长素（auxin）和油菜素内酯（BR）信号通路，扰乱植物生长，为理解细胞壁缺陷与植物发育调控机制提供新视角，值得关注。

　　### 引言
植物细胞被细胞壁包围，其主要成分包括纤维素、半纤维素（如木葡聚糖）和果胶。果胶中的鼠李半乳糖醛酸聚糖 - II（RG-II）高度分支，通过硼桥形成二聚体，这一过程对植物生长至关重要。拟南芥 mur1 突变体的 MUR1 基因缺陷，导致 RG-II 二聚化异常，虽其 RG-II 含量正常，但侧链两个岩藻糖基被半乳糖基取代，二聚化形成速率和稳定性受损，多数 RG-II 以单体形式存在，植株生长严重受阻，不过外源硼处理可恢复其 RG-II 二聚化并抑制生长缺陷。此前研究发现 mur1 突变体在顶端弯钩发育上存在严重缺陷，而顶端弯钩形成是研究器官弯曲组织的良好模型，主要由细胞伸长差异介导。本研究以此为切入点，探究 RG-II 二聚化缺陷在植物生长调控中的作用。

结果

1. 减少的 RG-II 二聚化破坏顶端弯钩发育：mur1 突变体存在 RG-II 二聚化缺陷，其顶端弯钩形成有严重缺陷，最大弯钩角度仅 150°，且比野生型打开更快。外源岩藻糖处理可抑制 mur1 弯钩缺陷，但因 GDP - 岩藻糖还参与木葡聚糖岩藻糖基化，为确定是 RG-II 二聚化缺陷还是木葡聚糖岩藻糖基化影响，研究分析 mur2 突变体（木葡聚糖生物合成中岩藻糖基化步骤缺陷），发现 mur2 无弯钩发育缺陷，表明 mur1 弯钩缺陷可能源于 RG-II 二聚化缺陷。此外，外源硼处理可恢复 mur1 突变体的弯钩缺陷，而硼酸衍生物苯硼酸（PBA）处理野生型会干扰弯钩发育，模拟 mur1 突变体表型，进一步证明减少的 RG-II 二聚化与 mur1 突变体弯钩缺陷相关。
2. 生长不对称性被破坏：顶端弯钩形成依赖于下胚轴两侧的差异生长，即外侧生长快、内侧生长受抑制。对比 mur1 突变体和野生型弯钩内外侧细胞伸长情况，发现 mur1 突变体弯钩外侧细胞伸长显著慢于野生型，内侧则相反，说明 mur1 突变体弯钩缺陷是由内外侧差异生长被破坏导致。硼处理可恢复 mur1 突变体弯钩内外侧的差异生长模式，使其接近野生型。
3. 生长素反应最大值减弱：生长素反应最大值在内侧对抑制生长和顶端弯钩正常发育至关重要。利用合成生长素反应报告基因 DR5-Venus 可视化发现，野生型下胚轴内侧生长素反应最大值比外侧强，而 mur1 突变体内侧 DR5-Venus 信号强度显著降低，表明其生长素反应最大值严重减弱，硼处理可恢复到野生型水平，这解释了 mur1 突变体弯钩缺陷的原因。
4. 极性生长素运输受干扰：极性生长素运输关键组件 PIN 和 AUX/LAX 基因对顶端弯钩生长素反应最大值很重要，其突变体会破坏生长素反应最大值并导致弯钩缺陷。研究对比 mur1 突变体和野生型顶端弯钩中 PIN 和 AUX/LAX 蛋白的质膜水平，发现 mur1 突变体中 PIN3、PIN4 和 AUX1 的质膜水平显著降低，补充硼可使其恢复到野生型水平。基因表达分析显示，mur1 突变体中 PIN3、PIN4 和 AUX1 转录水平降低，且添加硼可抑制这种降低，说明减少的 RG-II 二聚化导致极性生长素运输受干扰，进而减弱生长素反应最大值。
5. ARF7 和 ARF19 表达减弱导致 mur1 弯钩缺陷：生长素反应因子 ARF7 和 ARF19 在弯钩发育中起重要作用，arf7/arf19 双突变体表现出与 mur1 突变体类似的生长素反应异常和严重弯钩缺陷。研究发现 mur1 突变体中 ARF7 和 ARF19 表达显著降低，硼处理可使其恢复到野生型水平。进一步分析 arf7/arf19 突变体，发现其 PIN3、PIN4 和 AUX1 转录水平显著降低，表明 ARF7 和 ARF19 依赖的生长素途径减弱导致 mur1 突变体因 RG-II 二聚化减少出现弯钩缺陷。在 mur1 突变体中过表达 ARF7-mCherry 可完全抑制弯钩缺陷，证明 ARF7 和 ARF19 是连接细胞壁机械化学扰动和 mur1 突变体弯钩发育缺陷通路的下游靶点。
6. BR 生物合成基因表达下调：油菜素内酯（BR）与生长素一样参与弯钩发育，抑制 BR 生物合成会导致类似 mur1 突变体的弯钩缺陷，且 BR 和生长素信号通路在弯钩发育中有显著交互作用。研究测量 BR 生物合成基因表达，发现 mur1 突变体中 DWARF 4（DWF4）和 ROTUNDIFOLIA3（ROT3）转录水平显著降低，硼处理可使其恢复。补充外源 24 - 表油菜素内酯（EBR）可显著抑制 mur1 突变体弯钩缺陷，引入 BES1-D 突变体（BR 反应组成型激活）也可完全抑制 mur1 突变体弯钩缺陷，而 BR 生物合成抑制剂 brassinazole（BRZ）可阻断硼对 mur1 突变体弯钩缺陷的抑制作用。此外，arf7arf19 双突变体中 DWF4 和 ROT3 表达降低，说明 RG-II 二聚化受损可能通过减弱 ARF7 和 ARF19 表达下调 BR 生物合成相关基因，导致 mur1 突变体弯钩缺陷。
7. 增加 RG-II 二聚化增强 BR 信号：细胞壁机械化学变化可调节 BR 信号。研究以 BES1 为 BR 信号关键组件，通过检测磷酸化 BES1 与总 BES1 的比例来衡量 BR 信号激活程度。发现野生型和 mur1 突变体该比例无显著差异，但添加硼（增强 RG-II 二聚化）后，野生型和 mur1 突变体中去磷酸化 BES1 与总 BES1 的比例均显著增加，且 mur1 突变体背景下该比例低于野生型，表明增强 RG-II 二聚化可增强 BR 信号，有助于抑制 mur1 突变体弯钩缺陷。
8. BR 反馈调节 RG-II 二聚化：激素可影响细胞壁化学性质，如生长素通过酸化松弛细胞壁、调节果胶甲基酯化水平影响细胞伸长。研究发现外源 EBR 处理可增强 RG-II 二聚化，这可能是 EBR 抑制 mur1 突变体弯钩缺陷的部分原因。且 EBR 介导的对 mur1 突变体表型的抑制作用可被 PBA 阻断，进一步证明 BR 介导的抑制与硼介导的 RG-II 二聚化之间的联系，表明增强 BR 信号可通过 RG-II 二聚化对细胞壁产生正反馈。
9. 细胞壁缺陷的转导不依赖于 THESEUS1 和 RLP44：细胞壁机械性质扰动影响生长，受体样激酶 THESEUS1（THE1）和 RLP44 参与细胞壁完整性（CWI）传感，其缺失可抑制因细胞壁改变导致的弯钩缺陷。研究将 the1-1 和 rlp44 功能缺失突变引入 mur1 突变体，发现 mur1/the1-1 和 mur1/rlp44 双突变体与 mur1 突变体无明显差异，表明 mur1 突变体中导致弯钩发育破坏的细胞壁缺陷转导不依赖于 THE1 或 RLP44 通路。

讨论

细胞壁机械化学性质变化在植物形态发生中起关键作用，但细胞壁缺陷与下游通路的联系及对生长的影响尚未完全明确。本研究利用 mur1 突变体，揭示了细胞壁机械化学性质扰动如何调节对下胚轴弯曲至关重要的激素通路。

1. 与生长素的联系：RG-II 及其硼介导的二聚化对生长影响深远，mur1 突变体中 RG-II 二聚化减少导致细胞伸长缺陷，影响顶端弯钩外侧生长，同时内侧生长抑制失败，破坏差异生长。野生型顶端弯钩中，生长素反应不对称性调节差异生长，而 mur1 突变体中极性生长素运输关键组件 PIN3、PIN4 和 AUX1 质膜水平降低，导致生长素反应最大值被破坏，进而影响差异生长和弯钩发育。研究还发现抑制硼敏感的 RG-II 二聚化缺陷可恢复 mur1 突变体生长素反应最大值，揭示了细胞壁与生长素相互作用的新方面。此外，mur1 突变体中 ARF7 和 ARF19 表达降低，增强 ARF7 表达可抑制 mur1 突变体弯钩缺陷，且硼介导的 RG-II 二聚化对 mur1 突变体弯钩缺陷的抑制依赖于功能性 ARF7 和 ARF19，表明 ARF7/ARF19 是细胞壁因 RG-II 二聚化扰动导致机械化学变化信号通路的下游靶点，揭示了硼敏感的 RG-II 二聚化与生长素介导的差异生长通过 ARF7/ARF19 通路的联系。
2. 与 BR 的联系：mur1 突变体中 BR 生物合成相关基因 DWF4 和 ROT3 转录下调，硼处理恢复其表达，说明细胞壁缺陷与 BR 通路有关。此前有研究报道硼缺乏与拟南芥根中 BR 反应降低和生长缺陷相关，本研究中补充 BR 或增强 BR 信号可抑制 mur1 突变体弯钩表型，进一步支持了这一联系。此外，增强 RG-II 二聚化对 BR 信号有积极影响，阻断果胶甲基酯化也可增强 BR 信号，表明 BR 通路响应与细胞壁组成变化密切相关。同时，阻断 BR 反应会导致硼无法抑制 mur1 突变体弯钩缺陷，证明 BR 是响应细胞壁扰动（如 RG-II 二聚化减少）的弯钩发育下游组件。而且，BR 可增强 RG-II 二聚化，且 BR 介导的对 mur1 突变体弯钩缺陷的抑制依赖于 RG-II 二聚化，揭示了 BR 与 RG-II 二聚化之间的反馈回路。
3. 生长素与 BR 的相互作用：本研究将 BR 通路与生长素信号联系起来，mur1 突变体和 arf7arf19 双突变体中 BR 生物合成基因均下调，此前已知 ARF7 和 ARF19 通过调节生长素反应通路影响弯钩发育，本研究揭示它们还通过转录控制 BR 生物合成基因发挥作用。生长素和 BR 通路在多个发育过程中存在相互作用，如调节 BR 生物合成、参与极性生长素运输调控等，本研究为二者相互作用提供新证据，表明细胞壁扰动通过 ARF7 和 ARF19 转录因子影响生长素和 BR 通路相互作用。
4. 其他相关机制：多项研究表明果胶与植物生长控制有关，果胶水平变化影响细胞粘附和下胚轴机械性质，果胶甲基酯化水平改变影响细胞壁弹性和多个生长过程。本研究揭示了因 RG-II 二聚化减少导致的细胞壁扰动对控制弯钩发育的激素通路的影响，此前研究发现果胶甲基酯化影响生长素分布，本研究进一步揭示了细胞壁组成变化导致弯钩发育破坏的机制。细胞壁完整性（CWI）缺陷通常会导致细胞破裂，也会影响植物生长，如 mur1 突变体，但具体机制尚不明确。虽已知 THE1 和 RLP44 与 CWI 缺陷和弯钩发育破坏有关，但它们无法抑制 mur1 突变体弯钩缺陷，说明因 RG-II 二聚化导致的细胞壁缺陷可能通过独立于 THE1 或 RLP44 的途径被识别，反映了 CWI 传感系统的复杂性。其他受体样激酶如 FERONIA（FER）和 RESISTANCE TO FUSARIUM OXYSPORUM（RFO）也参与果胶组成改变导致的细胞壁缺陷转导，它们在感知 RG-II 二聚化受损导致的缺陷中的作用有待研究。

材料和方法

1. 植物材料：以拟南芥哥伦比亚生态型（Col-0）为野生型对照，使用 mur1-1、mur1-2、mur2-1、arf7arf19、the1-1、mur1 the1-1、bes1-D、mur1 bes1-D 等突变体，以及 DR5::Venus、mur1 DR5::Venus 等荧光标记株系进行研究。
2. 植物生长条件：植物在含有特定成分的 ? MS 培养基上生长，培养基经灭菌处理，种子需先在 4°C 黑暗中分层 2 天，再经 6 小时 21°C 白光照射后，在 21°C 垂直培养。硼补充通过添加硼酸实现，PBA 用于诱导硼缺乏，岩藻糖、硼酸和 PBA 需溶解、过滤灭菌后加入培养基。
3. 顶端弯钩发育的运动学分析：在黑暗中 21°C 条件下，用远红外光照射垂直板上生长的幼苗，每 4 小时用相机拍照，使用 ImageJ 软件处理图像，进行顶端弯钩发育的运动学分析。
4. RNA 分离和定量实时 PCR 分析：从 2 天龄黑暗生长幼苗的顶端弯钩中提取总 RNA，经 DNase 处理去除 DNA 污染后合成 cDNA，使用 Roche Light Cycler 480 热循环仪进行定量实时 PCR 分析，以 UBQ10 为参考基因计算相对表达值，引物序列在表 S1 中列出。
5. 突变体基因分型：利用 goTaq master mix 对拟南芥突变体进行基因分型，arf7arf19、the1-1、rlp44 和 bes1-D 按之前描述方法分型，mur1-2 使用表 S2 中的引物进行分型。
6. 共聚焦激光扫描显微镜观察：使用 Carl Zeiss LSM 780 共聚焦激光扫描显微镜对样品成像，激发 GFP 和 Venus 荧光并检测相应发射光，设置相同的共聚焦采集参数，用 ImageJ 软件量化荧光强度，每次实验至少分析 10 株幼苗和 60 - 70 个细胞。
7. 细胞伸长分析的时间推移成像：对表达质膜标记 Lti6a-GFP 的野生型和 mur1-2 幼苗的顶端弯钩，在垂直板上用 Nikon AZ-C2 垂直宏观共聚焦显微镜每 2 小时成像一次，共 8 小时，用 ImageJ 软件测量细胞长度并计算生长速率，分析每个基因型 3 - 5 株幼苗中顶端弯钩内外侧约 60 - 70 个表皮细胞。
8. 拟南芥下胚轴中 RG-II 硼桥接状态分析：对萌发 72 小时的拟南芥幼苗下胚轴进行一系列处理，包括乙醇、丙酮洗涤，用 Na?CO?去除甲酯基，再用内切多聚半乳糖醛酸酶消化，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染分析 RG-II 条带，扫描后用 Photoshop 分析灰度文件量化 RG-II 二聚体和单体带亮度，使用已知比例的标记混合物校准实验样品的二聚体：单体比例。
9. 免疫印迹分析：收集 4 天龄 Col-0 和 mur1-2 幼苗（± 硼处理）的下胚轴提取蛋白质，经研磨、匀浆、离心等步骤处理后，进行 SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜，用特定抗体进行免疫检测，使用 ChemiDoc MP 成像系统检测蛋白质，基于信号强度量化去磷酸化 BES1 与总 BES1 蛋白的比例，以微管蛋白作为上样对照，实验重复 4 次。
10. proML1:ARF7-mCherry 转基因植物的构建：按照类似已发表方法构建 proML1:ARF7-mCherry 载体，合成 ARF7 编码序列并克隆到质粒载体，再构建与 mCherry 的翻译融合，最终转化到农杆菌 GV3101 并通过浸花法转化拟南芥 Col-0，在含潮霉素 B 的培养基上筛选转化植株，选择 3 个独立转化体进行进一步分析。