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为探究 del-LMP1 和 LMP1 蛋白表达对 ENKTCL 患者临床病理及预后的影响，温州医科大学附属第一医院的研究人员开展相关研究。结果发现二者的相关特征。该研究有助于理解 ENKTCL 发病机制，推荐科研读者阅读。
温州医科大学附属第一医院（Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University）的研究人员邢梅星（Xingmei Lu）等人在《Diagnostic Pathology》期刊上发表了题为 “Detection of the 30?bp deletion and protein expression of Epstein?Barr virus latent membrane protein 1 in extranodal NK/T cell lymphoma and its clinicopathological significance” 的论文。这篇论文聚焦于结外自然杀伤 / T 细胞淋巴瘤（Extranodal natural killer/T-cell lymphoma，ENKTCL） 领域，对于深入理解 ENKTCL 的发病机制、临床病理特征以及预后判断具有重要意义，有望为该疾病的精准诊疗提供新的思路和理论依据。
研究背景
ENKTCL 是一种罕见的与爱泼斯坦 - 巴尔病毒（Epstein-Barr virus，EBV）相关的非霍奇金淋巴瘤亚型，临床进程高度侵袭性。它偏爱侵犯结外部位，尤其是上呼吸道消化道（Upper aerodigestive tract，UADT），还会累及皮肤、胃肠道、软组织和睾丸等。从组织学上看，ENKTCL 以血管侵犯、血管破坏，伴有显著的凝固性坏死和细胞毒性表型为特征 。该疾病在东亚和拉丁美洲地区更为常见，其发病机制虽尚未完全明确，但明显的地理分布差异暗示了遗传易感性在其中的作用。
EBV 是疱疹病毒科的一员，全球约 95% 的人口都感染过 EBV，且它会在人体内终身潜伏、无症状存在。自 1990 年以来，EBV 在 ENKTCL 淋巴瘤发生中的重要性逐渐被认识并得到多项研究证实。随后，研究人员将目光聚焦在 EBV 的病毒蛋白及其基因变异体上，试图探究它们在淋巴瘤发病机制中的作用。
潜伏膜蛋白 1（Latent membrane protein 1，LMP1）是 EBV 致癌的重要癌基因之一，能够诱导上皮细胞和 B 细胞发生恶性转化。LMP1 基因存在多态性，其中 30 碱基对缺失（del-LMP1）是其 C 末端最常见的变异形式，最早在华南地区的鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）患者中被发现。然而，对于 30 碱基对缺失在赋予 LMP1 基因更强致癌潜力方面的重要作用，学术界存在争议。一些研究表明 del-LMP1 与欧洲霍奇金病（Hodgkin's disease，HD）有关，且与侵袭性组织学或行为相关；但也有研究对此持否定态度，比如墨西哥的一项研究就对 del-LMP1 在 ENKTCL 中的明确致病作用提出质疑。此前的研究发现，B 细胞来源的 LMP1 分离蛋白具有高度免疫原性，而 LMP1 基因的突变可能会降低其免疫原性，使肿瘤细胞逃避免疫监视。因此，同时评估 del-LMP1 和 LMP1 蛋白表达，或许能让我们更深入地了解 LMP1 在 ENKTCL 发生和发展中的潜在作用。
研究方法
- 采样与数据收集：研究人员回顾性分析了 2016 年 1 月至 2022 年 6 月温州医科大学附属第一医院病理科 125 例 ENKTCL 患者的病历和样本。按照世界卫生组织（World Health Organization，WHO）造血与淋巴组织肿瘤分类标准进行诊断，排除了合并其他恶性肿瘤、术前接受过新辅助化疗和放疗以及数据不完整的患者。最终选取了 42 例组织材料充足的病例，用于进一步的巢式聚合酶链反应（Nested polymerase chain reaction，Nested PCR）和免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）检测。同时，选取 10 例鼻咽慢性炎症组织作为对照组，通过原位杂交（In situ hybridization，ISH）检测 EBV 编码的小 RNA（EBV-encoded small RNA，EBER）来确认 EBV 的存在。
- DNA 提取：从福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）的组织块中切取 5μm 厚的切片，获取 52 份符合条件的样本（42 例 ENKTCL 和 10 例对照组织）。为降低交叉污染风险，每份标本都使用新鲜的切片刀。随后，按照试剂盒说明书，利用 Biospin FFPE 组织基因组 DNA 提取试剂盒提取和纯化 DNA。
- 巢式 PCR 检测 LMP1 基因：采用巢式 PCR 扩增 LMP1 基因的 C 末端。第一轮扩增使用外引物 LMP1-F1 和 LMP1-R1，反应总体积为 20μl，包含 Taq PCR Master Mix 12.5μl、组织提取的 DNA 1μl、每种引物 1μl 以及 4.5μl 去离子无菌水（ddH?O）。反应程序为：98℃预变性 5 分钟，然后 95℃变性 30 秒、54℃退火 30 秒、72℃延伸 75 秒，共 30 个循环，最后 72℃延伸 10 分钟 。第二轮 PCR 使用内引物 LMP1-F2 和 LMP1-R2，以第一轮 PCR 产物 1μl 为模板，除延伸时间为 30 秒外，其他实验条件与第一轮相似。每次实验都分别设置阳性和阴性对照，引物根据标准菌株 EBV 95.8 设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成。
- 琼脂糖凝胶电泳：将巢式 PCR 产物在 1.2% 的琼脂糖凝胶中，以 1× Tris - 醋酸 - 乙二胺四乙酸（Tris-Acetate-EDTA，TAE）缓冲液进行电泳 45 分钟。凝胶用 4S 绿色核酸凝胶染色剂染色后，在紫外线下拍照，以 DNA 分子量标准（100 - 5000）作为标记。
- DNA 测序：从凝胶上切下目标特异性条带，使用琼脂糖凝胶 DNA 提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）按照说明书进行纯化。PCR 产物由上海生工生物工程股份有限公司采用桑格测序法（Sanger sequencing method）进行测序，测序引物为 LMP1-R2，测序结果用 MegAlign 软件进行分析。
- IHC 检测 LMP1 蛋白：对 3.5μm 厚的切片进行 IHC 检测。切片经二甲苯脱石蜡、梯度酒精水化后，在 95℃的 EDTA 缓冲液中进行抗原修复 20 分钟。用 3% 过氧化氢在室温下封闭内源性过氧化物酶活性 10 分钟，然后将切片与小鼠抗 LMP1 单克隆抗体（克隆 CS1 - 4，福建迈新生物技术开发有限公司）在 4℃孵育过夜，再与辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗在室温下孵育 20 分钟。以二氨基联苯胺作为免疫染色的显色剂，最后用苏木精复染。按照说明书，以 EBV 阳性的霍奇金淋巴瘤切片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。当淋巴瘤细胞呈阳性时，判定为 LMP1 阳性。
- 统计分析：使用 SPSS 26.0 软件进行统计分析。采用卡方检验和 Fisher 精确检验比较组间变量（计算分类变量）。总生存期（Overall survival，OS）从初次诊断日期计算至因任何原因死亡或最后随访日期。生存曲线用 Kaplan-Meier 法计算，用 log-rank 检验评估统计学意义。所有统计检验均为双侧，P 值≤0.05 被认为具有统计学意义。
研究结果
- 患者特征：42 例 ENKTCL 患者中，男性 31 例，女性 11 例，男女比例为 2.8:1。年龄范围在 21 - 87 岁之间，中位年龄为 55 岁，60 岁以上患者有 16 例。最常见的发病部位是 UADT（28 例），初始症状包括鼻出血、流涕和鼻塞等。13 例患者有 B 症状，18 例患者血清乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）水平升高。根据 Ann Arbor 分期，32 例患者为 I/II 期。形态学上，大多数病例表现为多形性浸润，22 例样本出现血管破坏，23 例组织存在不同程度的坏死。所有病例的 CD56 和颗粒酶 B 均呈阳性，Ki-67 的中位值为 80%（范围：35% - 98%）。所有病例的肿瘤细胞核中 EBER 信号均为阳性。20 例患者仅接受化疗，12 例接受放化疗联合治疗，3 例接受自体干细胞移植，3 例接受异基因干细胞移植。随访结束时，10 例患者死于疾病，中位生存期为 19.1 个月，1 年和 3 年估计生存率分别为 79.2% 和 69.3%。
- LMP1 基因和 del-LMP1 的检测：在 42 例 ENKTCL 病例中，37 例成功扩增出 LMP1 基因；在 10 例非恶性对照中，6 例扩增出 LMP1 基因。扩增 LMP1 基因后得到 251bp 和 221bp 两种 PCR 产物，经桑格测序证实，221bp 产物含有 30 碱基对的特殊缺失（从核苷酸 168255 到 168285）。结果显示，2 例 ENKTCL 患者为野生型 LMP1（wt-LMP1），35 例 ENKTCL 患者和 6 例非恶性对照为 del-LMP1。ENKTCL 患者和非恶性鼻咽组织之间 del-LMP1 的差异无统计学意义（P = 0.190）。del-LMP1 与性别、年龄、Ann Arbor 分期、B 症状、LDH、血管侵犯和坏死等临床病理特征均无明显相关性。
- LMP1 蛋白表达的检测：通过 IHC 染色检测 LMP1 蛋白表达，42 例 ENKTCL 标本中有 21 例检测到 LMP1 蛋白表达，10 例对照样本中有 4 例检测到，两组间差异无统计学意义（P = 0.729）。虽然大多数参数与 LMP1 蛋白表达无明显相关性，但在凝固性坏死组织中，LMP1 蛋白表达显著增加（P = 0.030）；LDH 升高的患者和年轻患者（≤60 岁）中，LMP1 蛋白表达有增加的趋势（P = 0.075 和 P = 0.057）。在 del-LMP1 组中，19 例 LMP1 蛋白呈阳性，蛋白表达与 30 碱基对缺失无相关性（P = 0.489）。进一步分析发现，del-LMP1 组中年轻患者（≤60 岁）的 LMP1 蛋白表达显著高于老年患者（>60 岁）（P = 0.004）。
- del-LMP1、LMP1 蛋白表达与生存结局的关系：35 例 del-LMP1 的 ENKTCL 患者中位生存期为 18.2 个月，1 年和 3 年 OS 率分别为 77.5% 和 62.0%。2 例 wt-LMP1 患者存活，随访期分别为 20 个月和 42 个月。虽然两组总生存期无显著差异，但 wt-LMP1 患者有预后更好的趋势（P = 0.331）。LMP1 蛋白阳性组的 1 年生存率（73.5%）低于阴性组（84.4%），但两组总生存期无统计学差异（P = 0.592）。在 del-LMP1 组中，LMP1 蛋白阳性和阴性患者的总生存期也无显著差异（P = 0.580）。
研究结论与讨论
在这项回顾性队列研究中，研究人员发现 del-LMP1 在研究人群中是最普遍的变异形式，但它与 ENKTCL 患者的总生存期以及所研究的临床病理特征均无关联。从分子流行病学的角度来看，del-LMP1 似乎是 ENKTCL 中的主要变异体，而非与表型相关的多态性。同时，研究还观察到 LMP1 蛋白表达在年轻的 del-LMP1 患者和坏死组织中更为常见。
ENKTCL 作为一种与 EBV 密切相关的疾病，LMP1 在其中的作用备受关注。本研究中，ENKTCL 病例中 LMP1 基因的高检测率（37/42，88.10%），不仅反映了 EBV 在 ENKTCL 中的高感染率，还提示 LMP1 可能参与了 ENKTCL 的发病和发展过程。然而，部分 ENKTCL 病例和对照组织中未能检测到 LMP1 基因，可能是由于 ENKTCL 的发生发展涉及多种因素，EBV LMP1 基因并非其必要病因；也可能是在淋巴瘤细胞分化增殖过程中 LMP1 片段丢失；还有可能是部分病例处于潜伏期 I，或者 EBV 感染的成熟静止 B 细胞为逃避免疫监视无需表达潜伏病毒蛋白。
对于 del-LMP1，虽然在多数 ENKTCL 患者中存在，但它与各种临床病理特征无相关性，这表明 del-LMP1 虽可能在 ENKTCL 肿瘤发生过程中参与细胞转化，但对临床特征和临床表现可能并无实际影响。在生存分析中，wt-LMP1 患者有更好的预后趋势，这或许与 del-LMP1 异常激活 NF-κB，使细胞抗凋亡，促进淋巴瘤发展有关；也可能是 del-LMP1 导致 LMP1 蛋白免疫原性减弱，让肿瘤细胞在免疫监视下获得生存优势，从而延长和增强致癌作用，维持或促进淋巴瘤的演变。不过，由于野生型病例数量有限，对 del-LMP1 的作用还需客观看待，不能简单将其视为 ENKTCL 的致病因素，但也不能完全否定其在淋巴瘤发生发展中的潜在作用。
在 LMP1 蛋白表达方面，本研究结果与以往研究有所不同。虽然之前有研究表明 LMP1 蛋白表达与 B 症状和解剖位置高度相关，但本研究并未发现这些显著差异。不过，研究观察到 LMP1 蛋白表达在 LDH 升高和年轻患者中有增加趋势，特别是在 del-LMP1 组中，年轻患者的 LMP1 蛋白表达显著高于老年患者。这一发现可能间接支持了携带 30 碱基对缺失的 LMP1 蛋白产物免疫原性降低，从而赋予肿瘤细胞生存优势并增强致病性的假设。同时，研究还发现 LMP1 阳性肿瘤细胞在凝固性坏死组织中更常见，这可能与 LMP1 阳性肿瘤细胞的细胞病变效应有关，但 LMP1 阳性表达与凝固性坏死之间关联的具体意义还需进一步研究。
此外，研究还提到了 del-LMP1 检测方法的进展。新一代测序（Next generation sequencing，NGS）技术虽能发现更多变异，但成本较高，且在分析和解释结果方面存在挑战，限制了其在诊断中的应用。而桑格测序法灵敏度高、操作方便、成本相对较低，在资源有限的国家可能更具应用价值。本研究中 LMP1 基因检测率显著高于蛋白检测率，可能与肿瘤细胞分化成熟不同阶段 LMP1 蛋白表达水平变化、其他影响转录和翻译水平的因素，或者技术原因（如福尔马林处理后抗原修复困难）有关，具体原因还需进一步研究探讨。
总体而言，这项研究为温州地区 ENKTCL 患者 LMP1 特征的研究提供了重要信息。不过，要全面阐明 LMP1 在 ENKTCL 中的意义，包括其预测和预后价值，还需要扩大样本量并持续随访研究。这不仅有助于深入理解 ENKTCL 的发病机制，还可能为未来的精准治疗提供更有力的理论支持，为改善 ENKTCL 患者的预后带来新的希望。
