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为解决胰腺癌免疫治疗难题，约翰霍普金斯大学医学院等机构的研究人员开展了胰腺癌肝肺转移小鼠模型对 IL-1β 阻断反应的研究。结果显示联合疗法效果因转移部位而异，该研究为胰腺癌免疫治疗提供新思路，值得科研人员一读。
胰腺癌转移小鼠模型对 IL-1β 阻断疗法的差异反应研究解读
在肿瘤研究领域，胰腺癌一直是极具挑战性的难题。近日，来自约翰霍普金斯大学医学院（Department of Oncology and The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine）等机构的研究人员，在《Experimental Hematology & Oncology》期刊上发表了题为 “Distinct response to IL-1β blockade in liver- and lung-specific metastasis mouse models of pancreatic cancer with heterogeneous tumor microenvironments” 的论文。这一研究对于深入理解胰腺癌的治疗机制、改善治疗策略具有重要意义，为攻克胰腺癌治疗难题提供了新的思路和方向。
一、研究背景
胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，其中胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）最为常见。PDAC 的肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）具有高度异质性，这一特点在肿瘤的生长、转移以及对治疗的反应中起着关键作用。TME 包含肿瘤浸润免疫细胞、癌相关成纤维细胞（Cancer associated fibroblasts，CAF）、血管和细胞外基质等多种成分，这些成分相互作用，共同营造了一个复杂的生态系统。
由于 PDAC 的间质呈纤维增生性，T 细胞浸润较差，且 TME 具有免疫抑制性，使得免疫检查点抑制剂（如抗 PD-1/PD-L1）在胰腺癌治疗中的临床效果远不如在其他恶性肿瘤中显著。尽管 PDAC 间质的异质性已得到广泛认可，但它对 PDAC 免疫治疗原发性耐药的具体作用机制仍不明确。因此，寻找能够有效靶向 PDAC 间质、克服免疫抑制性 TME 并与现有免疫疗法协同作用的药物迫在眉睫。
CAF 是 TME 的重要组成部分，根据其功能和表型的不同，可分为炎症性 CAF（iCAF）、肌成纤维细胞性 CAF（myCAF）和抗原呈递性 CAF（apCAF）等多种亚型。iCAF 能够分泌白细胞介素（Interleukin，IL）-6 等炎症因子，促进炎症反应，还可驱动 M2 巨噬细胞极化，吸引免疫抑制细胞如髓源性抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSC）进入 TME；myCAF 则主要分泌胶原蛋白和透明质酸等细胞外基质成分，对肿瘤的生长和转移起到支持作用。而 IL-1 作为一种促炎细胞因子，在调节炎症反应的同时，高表达的 IL-1 会导致慢性炎症，与肿瘤的发生、发展和转移密切相关。其中，IL-1β 作为 IL-1 的 β 亚基，不仅可以调节 iCAF 的生成，还能通过诱导免疫抑制细胞的浸润，改变 TME，颠覆抗肿瘤免疫。临床研究发现，肿瘤内和血清中高浓度的 IL-1β 与 PDAC 患者的化疗耐药和不良预后相关。
基于 IL-1β 的免疫抑制特性以及免疫检查点阻断疗法的发展，抗 IL-1β 和抗 PD-1 联合疗法受到了广泛关注。在临床前模型中，抗 IL-1β 单克隆抗体联合抗 PD-1 抗体在多种肿瘤模型中展现出了延缓肿瘤生长、增加 CD8 T 细胞浸润等效果。然而，这些令人期待的临床前研究结果并未在临床试验中得到有效验证。例如，CANOPY-1 试验表明，在非小细胞肺癌患者中，卡那单抗（Canakinumab，一种抗 IL-1β 的全人源单克隆抗体）联合派姆单抗（Pembrolizumab，抗 PD-1 抗体）并没有提高患者的无进展生存期和总生存期；在 PDAC 患者的相关试验中，虽然联合疗法显示出一定的安全性和可行性，但也未能提供有力证据证明其疗效。因此，研究人员推测抗 IL-1β 和抗 PD-1 联合疗法的抗肿瘤免疫反应具有环境依赖性，可能受到 PDAC 间质异质性的影响。
二、研究方法
（一）细胞系与细胞培养
研究使用了 KPC-4545 和 KPC-3403 两种肿瘤细胞系，它们均来源于 C57BL/6 背景的 KPC 转基因小鼠模型，分别具有肝转移和肺转移特性。KPC 细胞系在含有多种成分的 RPMI 1640 培养基中培养，包括 10% 胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、1% MEM-NEAA（非必需氨基酸）、1% 青霉素 / 链霉素、1% 丙酮酸钠和 1% L - 谷氨酰胺等，培养条件为 37°C、5% CO?。肿瘤浸润免疫细胞则在含有特定成分的 T 细胞培养基中处理。
（二）小鼠模型与体内实验
所有动物实验均经过当地机构动物护理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）批准，并遵循相关实验动物护理和使用准则。研究选用 6 - 8 周龄的 C57BL/6 小鼠，通过建立原位小鼠模型进行实验。具体方法是将 KPC 细胞接种到小鼠皮下，待形成皮下肿瘤后，将其切成小块，植入同系雌性 C57BL/6 小鼠的胰腺中。实验设置了多个治疗组，包括同型对照（人类 IgG、小鼠 IgG1）、抗 IL-1β 组、抗 PD-1 组以及抗 IL-1β + 抗 PD-1 联合治疗组，分别给予相应的抗体进行治疗。
（三）细胞处理与流式细胞术
在肿瘤植入后的第 13 天，切除小鼠原位胰腺肿瘤，对肿瘤浸润免疫细胞进行分析。首先对肿瘤组织进行机械和酶消化处理，经过一系列离心、裂解、密度梯度离心等步骤分离出肿瘤浸润免疫细胞。然后，对细胞进行染色，包括活 / 死细胞染色、表面抗体染色以及细胞内转录因子 FoxP3 染色等。最后，使用 CytoFLEX 流式细胞仪进行检测，并通过 CytExpert 软件分析数据，以研究不同治疗组对 T 细胞及其亚群的影响。
（四）单细胞核 RNA 测序（Single nuclear RNA sequencing，snRNAseq）及分析
基于改良的 10X Genomics 协议，从 KPC PDAC 肿瘤中分离单细胞核。对分离得到的单细胞核进行 cDNA 扩增，生成 snRNA-seq 数据。数据经过处理和分析，包括将 BCL 文件转换为 FASTQ 格式、比对转录组、提取分子标识符（Unique molecular identifiers，UMIs）和细胞核条形码等步骤，以生成数字基因表达矩阵。使用 Seurat v4.1.0 软件进行高可变基因识别、降维、无监督聚类等分析，并通过 Metascape 进行功能通路分析，使用 iTALK v0.1.0 推断细胞间的配体 - 受体相互作用。
三、研究结果
（一）联合治疗对原发性肿瘤生长和生存的影响
在具有肺转移倾向的 PDAC 原位小鼠模型（KPC-3403 细胞系）中，抗 IL-1β 和抗 PD-1 联合治疗虽然对原发性肿瘤生长没有明显抑制作用，但显著延长了小鼠的总生存期。通过超声测量肿瘤体积发现，联合治疗组与对照组、抗 IL-1β 单药治疗组和抗 PD-1 单药治疗组相比，在肿瘤大小上没有显著差异；然而，联合治疗组小鼠的生存曲线明显优于其他组。在具有肝转移倾向的 PDAC 原位小鼠模型（KPC-4545 细胞系）中，联合治疗不仅显著延缓了原发性肿瘤的生长，还延长了小鼠的生存期。在第 23 天，联合治疗组的肿瘤体积明显小于对照组，且生存曲线显示联合治疗组小鼠的生存时间更长。
（二）联合治疗对转移率的影响
在肺转移模型（KPC-3403）中，抗 IL-1β 和抗 PD-1 联合治疗显著降低了肺转移率。通过对解剖后的肺和肝进行大体和组织学检查发现，联合治疗组小鼠的肺转移率明显低于对照组、抗 IL-1β 单药治疗组和抗 PD-1 单药治疗组。而在肝转移模型（KPC-4545）中，联合治疗并没有降低肝转移率，各组之间肝转移率没有显著差异。
（三）联合治疗对 T 细胞活化的影响
通过流式细胞术分析肿瘤浸润白细胞（Tumor infiltrating leukocytes，TILs）发现，在 KPC-4545 模型中，抗 PD-1 单药治疗增加了 CD45 + CD4 + 细胞的比例，而在 KPC-3403 模型中未观察到这一现象。联合治疗在 KPC-3403 模型中增加了 CD8 + T 细胞的比例，而在 KPC-4545 模型中，联合治疗降低了 CD4 + PD1 + T 细胞的比例。这表明联合治疗能够恢复被单药治疗抑制的 T 细胞活化，且在不同转移倾向的模型中表现出不同的调节作用。
（四）联合治疗对髓系细胞的影响
在髓系细胞分析中，研究人员发现 KPC-4545 和 KPC-3403 模型在单核细胞 / 巨噬细胞（CD45 + CD11b + F4/80 +）、粒细胞（CD45 + CD11b + Ly6G +）和单核细胞来源的髓源性抑制细胞（M-MDSC，CD45 + CD11b + Ly6C high Ly6G -）等髓系亚群的比例上存在基线差异。在 KPC-4545 模型中，治疗后髓系细胞各亚群比例没有明显变化；而在 KPC-3403 模型中，抗 IL-1β 单药治疗导致单核细胞 / 巨噬细胞和粒细胞比例有增加趋势，抗 PD-1 治疗则降低了这两种细胞的比例。此外，抗 PD-1 单药治疗增加了 KPC-3403 模型中 M-MDSC 和粒细胞来源的髓源性抑制细胞（G-MDSC）的比例，而联合治疗降低了这两种细胞的比例，表明联合治疗在肺转移模型中能够逆转单药治疗导致的免疫抑制性髓系细胞增加的趋势。
（五）snRNA-seq 分析结果
snRNA-seq 分析显示，在细胞组成方面，KPC-3403 模型中的免疫细胞数量在绝对值和比例上均低于 KPC-4545 模型。在 CAF 表型方面，抗 IL-1β 治疗在 KPC-4545 模型中未显著改变 CAF 表型，仅使 CAF 簇 1 更倾向于 iCAF 表型；在 KPC-3403 模型中，抗 IL-1β 治疗也未显著改变 CAF 各亚群的表型，但增加了 CAF 的数量。在基因表达和信号通路方面，抗 IL-1β 治疗在不同模型中对不同细胞类型的基因表达和相关信号通路产生了不同影响。在 KPC-4545 模型中，抗 IL-1β 治疗抑制了 CAF 的功能，包括细胞骨架重排、形态发生、黏附和迁移等相关通路；同时抑制了 CD8 + 和 CD4 + T 细胞的活化，以及巨噬细胞的抗原呈递、先天免疫和炎症反应等功能。而在 KPC-3403 模型中，抗 IL-1β 治疗似乎增强了 CAF 和免疫细胞的浸润，但对其功能影响较小。
（六）配体 - 受体相互作用分析
利用 iTALK 分析配体 - 受体相互作用发现，抗 IL-1β 治疗在不同转移倾向的 KPC 肿瘤中对配体 - 受体信号传导产生了不同的调节作用。在生长因子方面，在 KPC-4545 肿瘤中，抗 IL-1β 治疗后 SIRPa 成为巨噬细胞上 VEGFs 的受体；在 KPC-3403 肿瘤中，FGFs 不再是主要配体，VEGF-A 取代 VEGF-C 成为主要配体，ITGs 成为 VEGF-A 和 VEGF-C 的主要受体之一。在细胞因子方面，抗 IL-1β 治疗后，IL-15 在两个模型中都成为更主要的配体，但其他细胞因子配体在两个模型中的变化有所不同。此外，抗 IL-1β 治疗还恢复了 KPC-3403 肿瘤中一些共刺激和检查点相互作用，使其与 KPC-4545 模型中的模式相似。
四、研究结论与讨论
本研究首次探讨了抗 IL-1β 和抗 PD-1 联合疗法在 CAF 异质性背景下的抗肿瘤免疫反应，为胰腺癌免疫治疗提供了重要的理论依据。研究结果表明，抗 IL-1β 和抗 PD-1 联合治疗在不同转移倾向的 PDAC 原位小鼠模型中表现出不同的治疗效果。在肺转移模型中，联合治疗虽然对原发性肿瘤生长影响较小，但能够降低肺转移率，延长生存期；在肝转移模型中，联合治疗能够延缓原发性肿瘤生长，但对肝转移率没有影响。
snRNA-seq 分析显示，抗 IL-1β 治疗在不同模型中对 CAF 和免疫细胞的浸润和功能影响不同。在肺转移模型中，抗 IL-1β 治疗似乎增强了 CAF 和免疫细胞的浸润，但对其功能影响较小；在肝转移模型中，抗 IL-1β 治疗则抑制了 CAF 和免疫细胞的功能。这些差异可能是导致联合治疗在不同转移模型中治疗效果不同的原因。
然而，本研究也存在一定的局限性。首先，研究没有比较原发性肿瘤和转移灶中 CAF 和免疫细胞的反应，这需要在未来的研究中进一步探索。其次，本研究仅使用了一种肝转移倾向和一种肺转移倾向的小鼠模型，后续需要建立更多的模型来验证研究结果。尽管如此，本研究支持了抗 IL-1β 和抗 PD-1 联合疗法的抗肿瘤免疫反应具有环境依赖性的假设，为进一步研究胰腺癌免疫治疗的机制和优化治疗策略提供了重要的方向。未来的研究可以基于这些发现，深入探究 CAF 和免疫细胞在 TME 中的具体作用机制，以及如何根据肿瘤的转移倾向和 TME 特征制定更精准的治疗方案，从而提高胰腺癌的治疗效果，为患者带来更多的希望。
