γδ t细胞对异位膜蛋白的自身反应：一种新的模式识别

　　

中国医学科学院基础医学研究所（Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences）的研究人员 Hongqin You、Xiangjin Zhang 等人在《Cellular & Molecular Immunology》期刊上发表了题为 “γδ T-cell autoresponses to ectopic membrane proteins: a new type of pattern recognition” 的论文。这篇论文在肿瘤免疫治疗和免疫识别机制领域具有重要意义，为深入理解 γδ T 细胞的功能以及开发新型免疫治疗策略提供了关键线索。

研究背景

γδ T 细胞是先天性免疫的保守淋巴细胞，在一线防御和免疫监视中发挥着重要作用。与传统的 αβ T 细胞不同，γδ T 细胞的 T 细胞受体（TCR）γδ 在识别蛋白质 / 非蛋白质配体时，无需主要组织相容性复合体（MHC）的辅助，尤其可通过直接结合蛋白质配体发挥作用，且这种结合主要依赖于 δ 链互补决定区 3（CDR3δ）。然而，人类 γδ TCR 识别蛋白质抗原的机制却一直不甚明了。

此前，研究人员发现 γδ TCR 可通过 CDR3δ 直接结合蛋白质配体，并鉴定出人类 MutS 同源 2（hMSH2）是 Vδ2 TCR 的配体。hMSH2 是一种 DNA 错配修复蛋白，在应激条件下会异位表达于细胞膜上。基于此，研究人员推测，应激诱导的细胞内自身蛋白的异位表达，可能会为 γδ TCR 提供潜在的自身抗原库。也就是说，γδ TCR 在应激状态下，会将体细胞细胞膜上的细胞内自身蛋白识别为非自身抗原，进而感知体细胞的损伤并迅速做出反应。为了验证这一假设，研究人员开展了此项研究。

关键技术方法

1. 合成生物素标记的 CDR3δ 肽及免疫组化：合成两种生物素标记的 CDR3δ 肽 GTM 和 OT3，利用包含 12 种不同器官肿瘤组织和匹配癌旁组织的 MC246a 肿瘤组织芯片进行免疫组化，检测其与肿瘤组织的结合情况。

2. 流式细胞术分析：运用流式细胞术，对 50 种人类肿瘤细胞系进行检测，分析 GTM 和 OT3 肽与肿瘤细胞系的结合活性，并与作为正常对照的人外周血单个核细胞（PBMCs）进行对比。同时，使用该技术检测多种蛋白在肿瘤细胞表面的表达情况，以及 γδ T 细胞的增殖、活化和亚型分布等。

3. 微尺度热泳（MST）：通过 MST 分析 GTM 和 OT3 肽与已知 γδ TCR 识别的应激诱导配体的结合活性，计算解离常数（Kd），以评估结合的强弱。

4. 蛋白质芯片筛选：应用重组 GTM 嫁接的 Vγ4δ1 - Fc 融合蛋白、GTM 嫁接的可溶性 γδ TCR 以及生物素 - OT3 肽作为探针，借助 HuProt?人类蛋白质组微阵列，高通量筛选 γδ TCR 的潜在蛋白配体。

5. 构建 CAR - T 细胞及体内外实验：设计以单链 Vγ9 - Vδ2（OT3）和 Vγ4 - Vδ1（GTM）为胞外结构域的 CAR 分子，构建 γδ CAR - T 细胞。通过体内外实验，评估其对肿瘤细胞的特异性结合和杀伤能力，以及对肿瘤生长的抑制作用。

6. 建立细胞应激模型：使用甲萘醌（menadione）建立 DNA 损伤诱导的细胞应激模型，模拟细胞在应激状态下的变化，研究应激对蛋白表达和 γδ T 细胞功能的影响。

7. 动物模型实验：建立多种动物肿瘤模型，如将 OVCAR - 8 细胞移植到 NOD - Prkdcem26cas9d52ll2rgem26cas9d22NjL（NCG）小鼠体内，以及将 SW480 细胞或 HepG2 细胞移植到 NOD.CB17 - PrkdcscidIl2rgtm1/Bcgen（B - NDG）小鼠体内，用于评估不同治疗策略的抗肿瘤效果。

研究结果

1. CDR3δ 可特异性结合肿瘤：研究人员合成的 GTM 和 OT3 肽能与多种不同的肿瘤组织结合，而与癌旁组织的结合较弱。通过流式细胞术分析 50 种人类肿瘤细胞系发现，这两种肽也能与多种肿瘤细胞系结合，但与正常的人 PBMCs 结合活性较低。MST 分析表明，GTM 和 OT3 肽还可与一些已知的 γδ TCR 识别的应激诱导配体结合。此外，构建的 γδ CAR - T 细胞在体外与肿瘤细胞共孵育时，会增加 CD69、TNF - α 和颗粒酶 B 的表达水平，且在体内外实验中均表现出对肿瘤细胞的杀伤活性，显著抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存时间。这表明 CDR3δ1 GTM 和 CDR3δ2 OT3 对肿瘤相关抗原有特异性结合和功能，可作为筛选人类 γδ TCR 蛋白配体的探针。

2. 绘制 γδ TCR 的蛋白配体图谱：基于来自 γδ 肿瘤浸润淋巴细胞（γδTILs）的两个肿瘤特异性 CDR3δ 序列，研究人员利用重组 GTM 嫁接的 Vγ4δ1 - Fc 融合蛋白、GTM 嫁接的可溶性 γδ TCR 和生物素 - OT3 肽作为探针，通过人类蛋白质组微阵列进行高通量筛选。结果在 21,000 种蛋白质中，发现 13 种蛋白质可特异性结合 GTM 嫁接的相关分子，3 种蛋白质可结合生物素标记的 OT3 肽。这些潜在的蛋白配体在生理上均位于细胞内的间隔区域，如细胞核或细胞质。这表明 γδ TCR 以类似模式识别的方式识别种类有限的蛋白配体。

3. 异位 NCL 是 Vδ1 TCR 的配体：NCL（核仁素，一种高度保守的 RNA 结合蛋白）主要在细胞核中表达，但在细胞应激或肿瘤细胞中，会异位表达于细胞质和细胞膜表面。尽管 MST 未检测到 GTM 等与重组 NCL 蛋白的直接结合，但免疫沉淀实验证实了它们之间的相互作用。免疫组化结果显示，NCL 在多种人类肿瘤组织中的表达上调。在细胞应激模型中，甲萘醌处理可使正常细胞和肿瘤细胞中 NCL 的异位表达增加。功能实验表明，重组 NCL 蛋白可特异性刺激 γδ T 细胞增殖，主要促进 Vδ1 T 细胞的增殖，并增加 γδ T 细胞激活标记 CD69 和 CD25 的表达。此外，阻断 NCL 会显著降低 Vδ1 T 细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。这证实了 NCL 在应激条件下异位表达于肿瘤细胞或正常细胞表面，是 Vδ1 T 细胞的应激诱导蛋白配体。

4. 针对异位应激诱导配体的抗肿瘤策略：基于 NCL 在肿瘤细胞膜上的异位表达，研究人员设计了两种基因工程 T 细胞 —— 经典 CAR - T 细胞和 Ab - γδ TCR - T 细胞，并以针对 hMSH2 的 CAR - T 细胞和 Ab - γδ TCR - T 细胞作为阳性对照。体外实验显示，这些工程 T 细胞对高表达相应异位蛋白的肿瘤细胞具有较强的细胞毒性。体内实验结果表明，hMSH2 和 NCL 靶向的 CAR - T 细胞和 Ab - γδ TCR - T 细胞均能显著抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存时间。这表明 NCL 可作为肿瘤免疫治疗的靶点。

5. 异位 TGM1 是 Vδ2 TCR 的配体：TGM1（转谷氨酰胺酶 1）在正常细胞中经甲萘醌处理后，会在剂量和时间依赖的方式下异位表达于细胞膜表面。在肿瘤组织和部分肿瘤细胞系中，也观察到 TGM1 的异位表达上调。MST 分析证实了 OT3 与 TGM1 的特异性结合，且重组 TGM1 蛋白可特异性上调 Vδ2 γδ T 细胞激活标记 CD69 和 CD25 的表达。这表明 TGM1 可异位表达于肿瘤细胞和应激处理后的细胞表面，是 Vδ2 γδ T 细胞激活和细胞毒性的配体。

6. 配体诱导的 γδ T 细胞细胞毒性：γδ T 细胞对 50 种人类细胞系中的 71.2% 表现出显著的细胞毒性，且这种细胞毒性与肿瘤细胞对 GTM 和 OT3 肽的结合活性、NCL 的异位表达呈显著正相关。对 13 种不同人类肿瘤细胞系中 11 种应激诱导配体的表达分析发现，ULBP1、ULBP2 和 HSP90 的表达与 γδ T 细胞的细胞毒性正相关。此外，γδ T 细胞敏感的细胞系中，大多数应激诱导蛋白的表达水平显著高于不敏感的细胞系，这证实了应激诱导的蛋白异位表达与人类 γδ T 细胞对肿瘤细胞的细胞毒性密切相关。

7. 放射治疗下的异位蛋白调节：放射治疗会导致肿瘤细胞发生形态变化，增加应激诱导蛋白 ULBP1、ULBP2、HSP60 和 MICA/B 的表达水平，同时显著增强人类 γδ T 细胞对这些照射后肿瘤细胞的细胞毒性。在移植瘤小鼠模型中，局部肿瘤部位进行两次低剂量（2 Gy）照射，可显著提高肿瘤对 γδ T 细胞介导的抗肿瘤活性的敏感性。与单独使用 γδ T 细胞治疗或放射治疗相比，联合治疗可显著延长荷瘤小鼠的生存时间，抑制肿瘤生长。这表明放射治疗可增加肿瘤细胞表面应激诱导蛋白配体的异位表达水平，进而促进 γδ T 细胞的抗肿瘤疗效。

研究结论与讨论

本研究发现，γδ T 细胞在应激条件下，能够识别多种细胞表面异位表达的细胞内自身蛋白，如 NCL 和 TGM1，这些蛋白可作为损伤相关分子模式（DAMP）被 γδ T 细胞识别。这种识别机制是一种新型的免疫模式识别方式，拓宽了人们对 γδ T 细胞抗原识别机制的理解。

γδ T 细胞独特的抗原识别模式，与传统免疫细胞的识别模式不同。它不像自然杀伤（NK）细胞激活那样，通过激活受体和抑制受体的相互调节来实现快速反应；也不像 αβ TCR 那样，识别抗原肽和 MHC 复合物。γδ TCR 主要利用 CDR3δ 序列的保守侧翼区域结合配体，决定了其识别的蛋白配体种类有限，这种独特的模式可视为模式识别机制的一种补充。

此外，研究还表明，通过放疗增加应激诱导的异位蛋白表达，或者直接靶向应激诱导的异位蛋白进行 Ab - TCR - T 细胞或 CAR - T 细胞治疗，为肿瘤、感染、衰老和自身免疫性疾病的治疗提供了新的思路和策略。这些免疫治疗策略具有广阔的应用前景，有望为相关疾病的治疗带来新的突破。

总的来说，该研究揭示了 γδ T 细胞识别蛋白质抗原的新机制，为免疫治疗领域开辟了新的方向，对推动相关疾病的治疗研究具有重要的科学价值和临床意义。