EXPERT扩展了prime编辑效率和大片段编辑的范围

prime编辑系统（PEs）具有很大的前景，尽管编辑范围仅限于pegRNA缺口的下游序列。在这里，作者报告了扩展的prime编辑系统（EXPERT），它克服了这一限制，使pegRNA标记的两侧都能进行有效的编辑。

　　

华中农业大学（Huazhong Agricultural University）动物育种与可持续生产前沿科学中心的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “EXPERT expands prime editing efficiency and range of large fragment edits” 的论文。这篇论文在基因编辑领域意义重大，为生命科学研究提供了新的有力工具，有望推动疾病治疗、作物改良等多方面的发展。

研究背景

在现代生物技术领域，引导编辑系统（Prime editing systems，PEs）备受瞩目，它为基因编辑带来了新的可能。PEs 最初是由化脓性链球菌 Cas9 切口酶（Strep. pyogenes Cas9 nickase，SpyCas9）（H840A）与经过改造的莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（Moloney-Murine leukemia virus reverse transcriptase，M-MLV RT）融合构建而成。在进行编辑时，会用到引导编辑向导 RNA（prime editing guide RNA，pegRNA），它包含定义靶位点的原间隔序列、sgRNA 支架以及编码所需编辑的 3' 延伸序列，这个 3' 延伸序列里有与 DNA 原间隔序列片段互补的引物结合位点（primer binding site，PBS）和编码所需编辑及基因组同源序列的逆转录模板（reverse transcriptase template，RTT）。

然而，现有的 PEs 存在明显的局限性。一方面，它们只能对 pegRNA 切口下游的基因组区域进行修饰，无法触及上游区域，这极大地限制了编辑范围。例如，在一些基因治疗场景中，需要编辑的关键位点可能恰好位于 pegRNA 切口的上游，现有 PEs 就无能为力。另一方面，PEs 的编辑效率也有待提高。尽管已有研究通过各种策略来改进，如用新凶手弗朗西斯菌（Francisella novicida ）的 Cas9 切口酶（H969A）替代 SpyCas9 切口酶（H840A）来扩大编辑范围 ；利用环形 RNA 介导的引导编辑（circular RNA-mediated prime editor，CPE）、模板跳跃引导编辑（template-jumping prime editing，TJ-PE）等方式拓展编辑范围；在 pegRNA 的 3' 延伸序列添加特定基序（如修饰的前 queosine1 - 1 核糖开关适体（evopreQ1）、Csy4、G - 四链体、病毒外切核糖核酸酶抗性 RNA 基序（xrRNA）、MS2 等）或对蛋白质工程改造（改变核定位信号组成、引入点突变改变氨基酸残基、添加额外肽或蛋白质结构域等）来提高编辑效率，但许多 PE 系统在人类细胞中编辑效率超过 10% 时，往往只能在切口下游约 10bp 的范围内实现 。此外，使用两个 pegRNA 的系统虽然在一定程度上扩大了编辑范围并提高了效率，如双 pegRNA（dual-pegRNA）、孪生引导编辑（twinPE）等，但这些系统中两个切口位于互补链上（trans），会增加诱导双链断裂（double-strand breaks，DSBs）的概率，而且依然无法编辑 pegRNA 切口的上游区域。因此，开发一种能够突破这些限制的新型引导编辑工具迫在眉睫。

关键技术方法

研究人员开发了扩展引导编辑系统（extended prime editor system，EXPERT）。该系统有两大关键创新点：一是引入了额外的上游 sgRNA（ups-sgRNA），它靶向 pegRNA 切口的上游基因组区域，与 ext-pegRNA 产生的切口位于同一条链上，形成 “顺式切口（cis nicks）”；二是使用了经过修饰的扩展 pegRNA（ext-pegRNA），其 3' 延伸序列更长且经过改造，包含 PBS 和 RTT，RTT 由编辑序列（edit sequence，ES）和同源序列（homologous sequence，HS）组成 。ext-pegRNA 的 3' 端 PBS 能够与 ups-sgRNA 产生的 3' Flap DNA 链结合，这种结合被称为 “上游结合”。通过这两个关键设计，EXPERT 有望实现对 pegRNA 切口上下游区域的高效编辑。

研究结果

1. EXPERT 策略的关键作用验证：研究人员通过构建不同的变体进行对比实验。与仅使用 ups-sgRNA 或 ext-pegRNA 产生一个切口的 EXPERT-a 和 EXPERT-b 相比，具有两个顺式切口的 EXPERT 在编辑 HEK4_2 位点并引入 40-bp 序列替换时，效率达到 6.1%，而 EXPERT-a 和 EXPERT-b 的效率分别仅为 2.84% 和低于 0.1%，这证实了两个顺式切口对 EXPERT 编辑能力的重要性。同时，对比缺乏上游结合设计的 PE2 变体与具有上游结合的 EXPERT，发现缺乏上游结合的 PE2 变体编辑效率极低，而 EXPERT 效率高达 6.1%，是 PE2 的 122.1 倍，从而确认了上游结合在 EXPERT 中的关键作用。此外，实验还表明，与单切口系统 PE2 相比，EXPERT 的两个顺式切口并没有增加靶位点意外插入缺失（indels）的发生率，在 HEK4_2 位点，EXPERT 的 indel 率为 0.28%，与 PE2 的 0.2% 相当。

2. 编辑范围的扩展：为了验证 EXPERT 能否编辑传统 PEs 无法触及的 pegRNA 切口上游区域，研究人员在 VEGFA_1 位点进行了多项编辑实验。在该位点的上游区域进行 37-bp 序列替换时，EXPERT 的替换效率高达 33.7%，indel 率仅 0.52%；进行 37-bp 序列删除时，精确删除率为 18.8%，indel 率为 0.8%。此外，在尝试同时对 VEGFA_1 位点上下游区域进行编辑（VEGFA_1 -37to-1 replace extended loxp and +1 TtoC）时，编辑效率达到 10.7%，indel 率为 0.38%。这些结果充分表明，EXPERT 具有编辑 pegRNA 切口上游区域以及同时编辑上下游区域的能力，且各类编辑的 indel 率都很低。

3. 两个顺式切口距离的影响：研究人员利用含有 mCherry 编码序列中提前终止密码子的 293T 报告细胞系，测试了不同顺式切口距离（distance between the two cis nicks，DCN）对编辑效率的影响。结果显示，当 DCN 在 38 - 96 nt 范围内时，可检测到 mCherry 信号，在 38 - 71 nt 之间信号更强，编辑效率在 1.74% - 7.44% 之间。在两个内源性位点 VEGFA_1 和 HEK4_1 的测试中发现，当 DCN 在 32 - 40 nt 时编辑率达到峰值。例如，在 VEGFA_1 位点，DCN 为 37 nt 时编辑率最高，达到 33.7%，indel 率为 0.52%；在 HEK4_1 位点，DCN 为 32 nt 时编辑率最高为 11.9%，indel 率为 2.23%。而当 DCN 过短（如 24 nt 或更短）时，编辑效率会显著降低，推测可能是由于相邻的两个 nCas9 蛋白之间存在空间位阻。因此，在 EXPERT 设计中，应避免使用 24 nt 或更短的 DCN，建议将 32 - 40 nt 的 DCN 作为起始设计。

4. 引入错配提高编辑效率：当编辑区域远离 ext-pegRNA 切口或 ups-sgRNA 切口时，原始单链 DNA 的基因组 3' 或 5' Flap 可能会与互补的 ext-pegRNA 杂交，从而阻碍逆转录酶的合成，影响新合成 DNA 链的产生。研究人员推测，在 ext-pegRNA 与 DNA 3' Flap 互补的区域引入错配，可以破坏这种杂交，进而提高编辑效率。实验结果证实了这一推测，在 HEK4_1 和 VEGFA_1 位点，引入错配后编辑效率显著提高。例如，在 HEK4_1 位点，引入一个错配就可使编辑效率从 0.54% 提高到 3.93%，且编辑效率的提升程度与引入错配的数量呈正相关。在两个位点分别引入 10 或 11 个错配时，编辑效率达到最高，VEGFA_1 位点为 24.81%，HEK4_1 位点为 14.43%。同时，引入错配还提高了产物纯度。此外，研究人员还测试了间隔引入错配的策略，发现这种方式的编辑效率与连续引入 11 个错配的效果相近。

5. 优化 PBS 和 HS 长度：PBS 在启动逆转录和确保引导编辑效率方面起着重要作用。研究人员在 VEGFA_1 和 PRNP 位点进行实验，测试不同 PBS 长度对编辑效率的影响。结果表明，PBS 长度在 9 - 16 nt 时可获得高效编辑结果，在两个位点，PBS 长度为 12 nt 时编辑效率最高，因此建议在 EXPERT 设计中使用 12 nt 的 PBS，避免使用短于 9 nt 的 PBS。对于同源序列（HS）长度的研究发现，HS 长度在 12 - 22 nt 时可实现有效编辑，当 HS 长度为 16 nt 或更长时，多个位点的编辑效率超过 6% 的比例明显增加，所以建议在 EXPERT 设计中，HS 长度从 16 nt 或更长开始考虑。

6. Helper gRNA 提升大片段编辑能力：研究人员测试了 EXPERT 在上游区域插入不同大小 DNA 片段的能力，发现当插入片段长度为 50 bp 时，在 EMX1 和 VEGFA_1 位点的编辑率均大于 10%，但随着插入片段增大（如 80 和 100 bp），编辑率急剧下降，不过 100 bp 片段在两个位点仍能达到大于 5% 的插入率。为了提高大片段插入的效率，研究人员引入了 Helper gRNA，它位于 ups-sgRNA 和 ext-pegRNA 之间。在 293T 报告细胞系以及 EMX1 和 VEGFA_1 内源性位点的实验表明，添加 Helper gRNA 后，编辑效率显著提升。例如，在 EMX1 位点进行 88-bp 替换时，效率从 0.21% 提升到 3.1%，提高了 15 倍；在 VEGFA_1 位点进行 75-bp 替换时，效率从 1.13% 提升到 6.86%，提高了 6.1 倍，且 indel 率始终保持在较低水平（0.15% - 0.2%），这表明引入 Helper gRNA 可在不增加 indel 率的情况下，提高 EXPERT 对大片段替换编辑的能力。

7. 产品纯度和脱靶效应评估：研究人员将 EXPERT 与代表性的单 pegRNA 系统 PE2 和双 pegRNA 系统 twinPE 进行比较。在与 PE2 的对比中，EXPERT 在编辑大片段时编辑效率显著提高，对于 24 - 66 bp 的插入编辑，EXPERT 的效率比 PE2 高 1.5 - 3.4 倍；对于 30 - 43 bp 的删除编辑，高 1.7 - 15.7 倍；对于 34 - 43 bp 的等距碱基替换编辑，高 1.3 - 3.2 倍，总体平均提高 3.12 倍，且两者的靶位点 indel 率没有差异。在与 twinPE 的对比中，虽然两个系统的编辑效率在不同位点有所差异，但 EXPERT 在所有编辑中都实现了更高的纯度，纯度提高了 1.5 - 5.7 倍。此外，通过全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）评估 EXPERT 的脱靶效应，发现其 gRNA 非依赖性和 gRNA 依赖性脱靶效应都极小，基因组范围内的碱基替换和 indel 水平与对照组相比没有显著差异，所有预测的潜在脱靶位点的 indel 频率均低于 0.1%。

8. EXPERT 与不同 PE 系统的兼容性及在多种细胞中的应用：研究人员构建了 EXPERTmax，即将 ups-sgRNA 和 ext-pegRNA 引入 PE2max。与 PE2max 及其他后续版本的 PEmax 系统（PE3max、PE4max、PE5max）相比，EXPERTmax 的编辑效率更高，产物纯度也更高。在不同物种的多种细胞类型中测试 EXPERTmax 发现，在人类细胞系（K562、Jurkat、Hela、HFL1）、小鼠细胞系 N2a 和猪胎儿成纤维细胞（pig fetal fibroblast，PFF）中，EXPERTmax 均能显著提高编辑效率，且大多数编辑的意外 indel 率没有显著增加，整体产物纯度更高。例如，在猪 PFF 细胞的 susANTXR1 位点，编辑效率从 0.23% 提高到 9.13%，提高了 39.7 倍。这表明 EXPERTmax 可应用于不同哺乳动物物种的细胞编辑。

9. 生成疾病相关突变的应用：研究人员利用 EXPERTmax 在人类细胞中生成与囊性纤维化（Cystic fibrosis，CF）相关的突变，以证明其在人类生物医学研究中的潜在应用价值。CF 是一种由囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因突变引起的致命遗传性疾病。研究人员在 CFTR 基因外显子 4 中生成一个携带多个已知 CFTR 突变的 36 bp 大片段突变序列，结果显示，EXPERTmax 的编辑效率（9.18%）显著高于 PE2max（2.33%）和 PE3max（3.66%），使用 “EXPERTmax + 切口 sgRNA” 后效率进一步提高，达到 11.8%，是 PE3max 的 3.2 倍，PE2max 的 5.1 倍，且 EXPERTmax 的 indel 率极低，产物纯度更高，这表明 EXPERTmax 在人类疾病转化研究中具有重要价值。

研究结论与讨论

研究人员成功开发了引导编辑工具 EXPERT，它通过使用额外的 ups-sgRNA 和 ext-pegRNA，实现了对 pegRNA 切口上游区域的高效编辑，极大地扩展了编辑范围。在编辑效率方面，与 PE2 相比，EXPERT 显著提高了大片段编辑的效率，平均提升 3.12 倍，最高可达 122.1 倍。在安全性方面，EXPERT 策略不会增加脱靶效应的风险，且与 PE2 相比，靶位点的 indel 发生率相当。

与其他产生多个切口的引导编辑系统（如 twinPE 等双 pegRNA 系统）不同，EXPERT 的两个切口为顺式（在同一条链上），这种设计在距离不超过 88 nt 时，不会增加双链断裂的风险，实验中观察到的 indel 率也较低（0.1% - 4.2%），而 twinPE 的 indel 率可高达 57%。这表明引入顺式切口是提高引导编辑系统性能的有效且安全的方式。

此外，EXPERT 策略具有广泛的适用性，理论上可应用于其他基于切割靶 DNA 的引导编辑系统，如 PE6（PE6ag）和 PE7 等 。研究人员构建的 EXPERTmax 在不同物种的多种细胞类型中都表现出高效的编辑能力，还成功应用于生成疾病相关突变，为人类疾病的研究和治疗提供了新的手段。

然而，EXPERT 也面临一些挑战。长 pegRNA（如 EXPERT 中的 ext-pegRNA）存在易被核酸外切酶降解、易形成二级结构（尤其是小编辑时）以及化学合成困难等问题。虽然引入错配可在一定程度上缓解二级结构问题，添加保护基序可能解决核酸外切酶降解问题，但仍需进一步测试和优化。另外，EXPERT 更适合大片段编辑，对于小编辑的效率和产物纯度还有待提高，在这方面，碱基编辑器和 PE3 等工具在单碱基替换和小编辑中仍具有优势。同时，如何最小化 gRNA 非依赖性脱靶效应是引导编辑研究的普遍挑战，EXPERT 在这方面也需要进一步探索。

总的来说，EXPERT 作为一种新型的引导编辑工具，为生命科学研究提供了强大的技术支持，在基因功能研究、疾病治疗、作物改良等领域展现出巨大的应用潜力，随着后续的优化和改进，有望为相关领域带来更多突破。