瘤内注射mRNA COVID-19疫苗可延缓小鼠黑色素瘤的生长

　　

美国西弗吉尼亚大学（West Virginia University）的研究人员在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Intratumoral administration of mRNA COVID-19 vaccine delays melanoma growth in mice” 的论文。这篇论文在癌症免疫治疗领域意义重大，为探索新的癌症治疗策略提供了重要的理论依据和实验基础，有望为黑色素瘤等癌症的治疗开辟新的方向。

研究背景

免疫疗法是癌症治疗的有效手段，但在 “冷” 肿瘤微环境（肿瘤组织中免疫细胞浸润较少的环境）中，由于缺乏浸润的 CD8+ T 细胞（在抗癌免疫反应中起关键作用的免疫细胞），其疗效受到限制。黑色素瘤患者的生存情况与肿瘤微环境中 CD8+ T 细胞的浸润增加相关 ，肿瘤内 T 细胞的存在也是免疫治疗反应的重要预测因素。然而，大多数黑色素瘤患者对免疫疗法没有反应，这主要是因为这类癌症中 “冷” 肿瘤微环境普遍存在，免疫 T 细胞浸润较低。因此，开发能够增加 CD8+ T 细胞向肿瘤部位募集的肿瘤微环境调节策略，将 “冷” 肿瘤微环境转化为富含免疫细胞的 “热” 微环境，增强抗癌反应，成为当前癌症研究的关键需求。

此前，人们尝试利用趋化因子和细胞因子吸引 T 细胞到肿瘤部位，但全身给药存在引发细胞因子风暴（一种异常炎症可导致宿主组织和系统受损的情况）的风险。疫苗能够在不接触完整病原体的情况下，通过低剂量抗原诱导免疫记忆反应，引起细胞因子的轻度和短暂增加。因此，肿瘤内注射疫苗以增强 T 细胞在肿瘤微环境中的局部募集，成为一种有吸引力的替代方法。已有研究表明，肿瘤内注射 FDA 批准的流感疫苗联合破伤风 / 百日咳 / 白喉疫苗，以及注射百日咳无细胞疫苗和 COVID-19 疫苗，都显示出一定的抗肿瘤效果 。基于这些背景，研究人员提出假设：通过肿瘤内注射 mRNA COVID-19 疫苗，可能会诱导免疫反应，促使 CD8+ T 细胞进入肿瘤，进而抑制肿瘤生长。

研究方法

1. 细胞培养：使用来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）的 B16F10 和 YUMM1.G1 黑色素瘤细胞。B16F10 细胞在添加 10% 热灭活胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中培养，YUMM1.G1 细胞在添加 10% 热灭活 FBS 和 1% 非必需氨基酸（NEAA）的 DMEM:F12 培养基中培养，细胞培养条件为 37°C、5% 二氧化碳的湿润环境，且所有细胞系均检测为支原体阴性。

2. 体外研究：将 2×10?个 B16F10 细胞接种于 6 孔板，接种 40μg 的 mRNA-1273 SARS-CoV-2 疫苗后培养 96h，每 24h 收集细胞培养上清液和细胞裂解物。通过蛋白质免疫印迹法（western blot）检测 SARS-CoV-2 刺突蛋白的产生，使用 RIPA 缓冲液和 HALT 蛋白酶抑制剂制备细胞裂解物，用 Bolt 4 - 12% Bis-Tris Plus 蛋白凝胶进行电泳，并转移到 PVDF 膜上，用 3% BSA 在 Tris - 磷酸盐缓冲液中封闭，使用康复期 SARS-CoV-2 感染小鼠的血清和刺突 S1 亚基作为阳性对照。

3. 体内皮下肿瘤模型：在西弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（协议号：2109047227）后进行动物实验，实验方法遵循 IACUC 指南和 ARRIVE 指南。将 5×10?个 B16F10 细胞皮下注射到 8 周龄雌性 C57BL/6 小鼠的右侧胁腹，待肿瘤可触及时，每 3 - 4 天用卡尺测量肿瘤大小。当肿瘤直径达到 5mm 时，将小鼠随机分组，分别进行肿瘤内（IT）注射 20μL 的 3μg mRNA-1273、空脂质纳米颗粒（LNP）或 PBS 对照。mRNA-1273（也称为 Spikevax?，Moderna）疫苗从 WVU Medicine Pharmacy 获得，空 LNP 通过闪式纳米沉淀法制备。部分小鼠接受免疫检查点疗法（ICT），即首次腹腔注射 200μg 抗 CTLA-4 和 200μg 抗 PD-1，随后每 3 天腹腔注射 2 剂 100μg 抗 CTLA-4 和 100μg 抗 PD-1。抗 CTLA-4（9D9）和抗 αPD-1（RMP1 - 14）从 Bio X cell 获得。在 prime/boost 研究中，小鼠在 6 周龄时肌肉注射 mRNA-1273，2 周后接种 B16F10 肿瘤细胞，4 周后进行肌肉注射 mRNA-1273 加强免疫，当肿瘤直径达到 5mm 时，进行 IT 注射。

4. 流式细胞术：在 8 周龄 C57BL/6 小鼠肌肉注射 50μL 的 50μg mRNA-1273 疫苗或 PBS 对照 24h 后，通过戊巴比妥注射安乐死小鼠，分析注射部位的肌肉和腹股沟淋巴结中的细胞。在不同时间点，通过二氧化碳窒息法安乐死荷瘤小鼠，收集脾脏、淋巴结和肿瘤的单细胞悬液，使用小鼠肿瘤解离试剂盒或骨骼肌解离试剂盒解离肿瘤和肌肉组织，用 1X 红细胞裂解缓冲液裂解红细胞，剩余细胞在细胞染色缓冲液中重悬，用 10μg/ml ChromPure 小鼠 IgG 阻断 Fc 受体，与抗体混合孵育，固定、通透化后，使用 Cytek? Aurora 进行检测，数据使用 FCS express 分析，门控策略见补充图 S13。

5. 活体成像：使用 8 周龄雄性和雌性 C57BL/6 小鼠进行皮肤窗口室植入、成像和分析。在皮肤窗口室植入和 B16F10 细胞接种后第 2 天进行显微镜观察，通过眼眶后注射 50μL 的 0.15μg CD8a - APC 抗体，30min 后在 20X 物镜下使用 3 个视野进行显微镜成像，以 GFP 观察 B16F10 肿瘤。随后进行 IT 注射 10μL 的 1.5μg mRNA-1273 或 PBS 对照，24h 后再次进行活体显微镜观察，使用 Nikon Elements 软件和自动测量分析宏对图像进行分析。

6. 细胞因子分析：在治疗过程中的不同时间点，通过下颌下出血采集皮下荷瘤小鼠的血液，储存于 - 80°C 直至分析。使用血清分离微量滴定管制备血清，使用 V-Plex Mouse Cytokine 19-Plex 试剂盒按照制造商的方案分析细胞因子。

7. 单细胞 RNA 测序：在 IT 注射 mRNA-1273 或 PBS 4 天后，通过二氧化碳窒息法安乐死小鼠，将肿瘤捣碎并通过 70μm 细胞过滤器洗涤以获得单细胞悬液，样本按组汇集并等比例混合。用 7-AAD 染色，使用 BD FACSAria? III 细胞分选仪分选活细胞，使用 Chromium Next GEM Single Cell 5’ Kit 提取 RNA，进行单细胞 RNA 测序分析，使用 Loupe Browser（7.0.1）进行数据分析，过滤低质量读数，根据基因表达注释细胞类型。

8. 抗 SARS-CoV-2 RBD IgG 抗体定量：在多次（3X）mRNA-1273 IT（3μg）治疗的小鼠最后时间点（约初始剂量后 20 天）收集血清，6 周龄非荷瘤 C57BL/6 小鼠接受 1 次 5μg mRNA-1273 肌肉注射，14 天后收集血清。使用 ELISA 法测定抗 SARS-CoV-2 RBD IgG 水平，用 WA-1 S RBD 包被高结合微量滴定板，封闭后，血清进行系列稀释并孵育，加入二抗孵育，洗涤后用 TMB 底物显色，使用 BioTek Synergy H1 多功能读数仪在 450nm 处读取吸光度，使用 GraphPad prism 进行曲线下面积分析定量血清抗体水平。

9. 统计分析：使用 GraphPad Prism V10.1.0 进行绘图和统计分析，数据以平均值 ± 标准差表示。对于三组或更多组或变量的分析，进行方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 或?ídák 多重比较检验；生存曲线的分析使用对数秩（Mantel-Cox）分析；两个正态分布配对测试组之间的差异分析使用 Student's t 检验，p<0.05 被认为具有统计学意义。

研究结果

1. mRNA COVID-19 免疫导致 CD8+ T 细胞增加：COVID-19 大流行促使 mRNA 疫苗广泛使用，其中 mRNA-1273 疫苗已在临床前和临床研究中被广泛研究，且已知其能诱导 Th1 偏向的免疫反应。研究人员给健康的 C57BL/6 小鼠肌肉注射高剂量的 mRNA-1273 疫苗，24h 后发现，与 PBS 对照组相比，注射部位的肌肉和淋巴结中的 CD8+ T 细胞显著增加。在体外实验中，B16F10 黑色素瘤细胞与 mRNA-1273 孵育后，能够表达 SARS-CoV-2 刺突蛋白，且在孵育 24h、48h 和 72h 均可检测到蛋白表达，同时，B16F10 细胞摄取 mRNA-1273 脂质纳米颗粒后，培养介质中 CXCL10（一种参与 T 细胞募集的趋化因子）的产量增加。

2. 单次肿瘤内注射 mRNA COVID-19 疫苗显著延迟肿瘤生长：研究人员利用皮下 B16F10 肿瘤模型评估 mRNA-1273 疫苗对黑色素瘤的潜在影响。当 B16F10 肿瘤直径达到 5mm 时，进行 IT 注射 3μg mRNA-1273、空 LNP 或 PBS。结果显示，与接受空 LNP 或 PBS 的肿瘤相比，接受 mRNA-1273 治疗的肿瘤生长明显延迟。在 IT 注射后第 8 天，空 LNP 和 PBS 处理的肿瘤大小是 mRNA-1273 处理肿瘤的 2 倍。同时，接受 mRNA-1273 治疗的小鼠生存时间显著延长。在另一种黑色素瘤模型 YUMM1.G1 中重复实验，也得到了类似的结果，即 IT 注射 3μg mRNA-1273 显著延迟了肿瘤生长。

3. mRNA-1273 增加肿瘤微环境中的 CD8+T 细胞：利用皮肤褶皱窗口室小鼠模型进行活体成像，研究人员评估了 IT 注射 mRNA-1273 或 PBS 后肿瘤微环境中 CD8+ T 细胞频率的变化。结果发现，在 mRNA-1273 治疗 24h 后，B16F10 肿瘤中的 CD8+ T 细胞显著增加。通过流式细胞术分析免疫细胞浸润情况，发现 IT 注射 mRNA-1273 24h 后，B16F10 肿瘤体积显著减小，且在 4 天后，mRNA-1273 治疗的肿瘤中 CD8+ T 细胞显著增加，约三分之二的 CD8+ T 细胞为 Granzyme B+，与空 LNP 或 PBS 对照组相比，分别增加了 7 倍和 10 倍；约一半的 CD8+Granzyme B+ T 细胞为 CD62L+，也显著增加。此外，mRNA-1273 治疗的肿瘤中 CD4+ T 细胞也显著增加。

4. 多次 mRNA 1273 IT 注射导致肿瘤生长的增强抑制：虽然单次 mRNA-1273 IT 注射显著减小了肿瘤体积，但未观察到长期生存或完全肿瘤消退。因此，研究人员评估了多次 mRNA-1273 IT 注射的抗肿瘤反应。当肿瘤直径达到 5mm 时开始 IT 注射，每 3 天注射一次，共注射 3 剂。结果显示，与空 LNP 或 PBS 对照组相比，三次 IT 注射 3μg mRNA-1273 显著延迟了肿瘤生长，接受三次 IT 注射 mRNA-1273 的小鼠生存时间显著增加。与单次注射相比，三次 IT 注射在第 8 天显著降低了肿瘤体积。此外，研究还发现多次 IT 注射 mRNA-1273 可诱导部分远隔效应（abscopal effects），即治疗一个肿瘤对远处的另一个肿瘤产生积极影响。

5. mRNA COVID-19 疫苗增强免疫检查点治疗反应：鉴于 IT 注射 COVID-19 疫苗可增加 CD8 + 和 CD4+ T 细胞，研究人员评估了 mRNA-1273 IT 治疗与免疫检查点疗法（ICT）协同作用的可能性。在 IT 注射 mRNA-1273 或空 LNP 4 天后，进行 ICT 治疗（抗 PD-1 和抗 CTLA-4），共 3 剂，间隔 3 天。结果显示，mRNA-1273 和 ICT 联合治疗显著减小了 B16F10 肿瘤体积，延长了小鼠生存时间。多次 mRNA 1273 注射与 ICT 联合治疗进一步增强了治疗效果，显著降低了肿瘤生长，延长了生存时间。而单独 IT 注射 mRNA-1273 或与 ICT 联合治疗，在 B16F10 肿瘤中未观察到明显差异，但在 YUMM1.G1 肿瘤中，单次 IT 注射 mRNA-1273 后 1 天进行 ICT 治疗，显著延迟了肿瘤生长。

6. IT 注射 mRNA-1273 不会导致全身细胞因子反应或肿瘤转录变化：研究人员评估了 IT 注射 mRNA-1273 48h 后肿瘤、淋巴结和血清中细胞因子的变化，以确定是否存在全身反应。结果发现，在 48h 时间点，mRNA-1273 或 PBS 处理的荷瘤小鼠在肿瘤、淋巴结或血清中的促炎细胞因子均无显著差异。即使多次注射 IT mRNA1273，也未检测到抗 SARS-CoV-2 RBD IgG 的血清转化。通过单细胞 RNA 测序（scRNAseq）分析 mRNA-1273 的转录效应，发现 IT 注射 mRNA-1273 在 4 天后，与 PBS 处理的肿瘤相比，细胞群体聚类和 CD8+ T 细胞比例均无显著变化，且未观察到促炎基因如 Cxcl10 的差异。

研究结论与讨论

本研究表明，肿瘤内注射 mRNA-1273 COVID-19 疫苗可通过增强 CD8+ T 细胞向肿瘤微环境的浸润，抑制黑色素瘤生长，显著延长小鼠生存时间。这一发现为癌症免疫治疗提供了新的思路和潜在的治疗策略。

在机制方面，虽然体外实验中 B16F10 黑色素瘤细胞摄取 mRNA-1273 后表达刺突抗原并产生 CXCL10，但在体内 IT 注射 mRNA-1273 后，局部和全身的 CXCL10 及其他细胞因子变化并不明显，然而肿瘤体积仍显著减小，且肿瘤微环境中 CD8+ T 细胞增加。这表明可能存在其他未明确的机制参与了 mRNA-1273 的抗肿瘤作用。此外，mRNA-1273 治疗后黑色素瘤特异性 T 细胞的短暂存在，以及全身免疫变化的轻微，可能是导致缺乏持续、持久抗癌反应的原因。

与免疫检查点疗法（ICT）联合使用时，mRNA-1273 显示出增强 ICT 疗效的潜力，但这种增强效果似乎与治疗时间和剂量有关。多次 mRNA-1273 IT 注射后 1 天进行 ICT 治疗，可显著增强抗肿瘤反应，这可能与 mRNA-1273 IT 注射 24h 后观察到的 B16F10 特异性 CD8+ T 细胞浸润增强有关。

研究还发现，PBS 注射可导致肿瘤和引流淋巴结中 CD3+ T 细胞亚群增加，但未观察到肿瘤抑制，而 mRNA-1273 治疗不仅增加了 CD8+ T 细胞，还提高了 TRP-2 特异性细胞水平，这表明 mRNA-1273 的抗肿瘤作用具有特异性。此外，mRNA 疫苗的脂质成分、mRNA 本身以及生产过程中的杂质可能会影响疫苗的免疫原性，未来研究可通过改变 LNP 成分来进一步增强免疫激活和抗肿瘤反应。

本研究也存在一些局限性。例如，研究中仅评估了一种 B16F10 抗原 TRP-2 来量化黑色素瘤特异性反应，未来研究可考虑检测更多的 B16F10 新抗原特异性抗体和 T 细胞，以更全面地评估抗癌免疫相关性。同时，研究未深入探讨 Th1 介导的免疫及其对观察结果的潜在贡献，且单细胞 RNA 测序分析可能由于质量控制步骤而忽略了肿瘤转录组的细微变化，未来研究可在更早期时间点进行分析。

总体而言，这项研究为 mRNA 疫苗在癌症治疗中的应用提供了重要的实验依据，有望推动癌症免疫治疗领域的进一步发展，为开发更有效的癌症治疗方法奠定基础。