《Scientific Reports》胞质外sigma因子σX支持芽孢杆菌118的生物膜形成，提高了芽孢杆菌118的生物防治效果

　　

华南农业大学自然资源与环境学院的研究人员 Yanfei Cai、Huan Tao 等人，在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “The extracytoplasmic sigma factor supports biofilm formation and increases biocontrol efficacy in Bacillus velezensis 118” 的论文。该研究聚焦于植物根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR），在农业生物防治领域具有重要意义，为开发更高效的生物防治策略、保障作物健康生长提供了关键的理论依据和实践指导。

研究背景

随着全球人口增长和气候变化，保障粮食安全成为紧迫问题。大量使用化学农药和化肥虽能提高农业产量，但会破坏土壤生态平衡，导致土壤盐度失衡、农产品残留有毒物质，还使土传病害频发。利用植物根际促生菌（PGPR）改良土壤，被视为一种可持续的作物病害管理策略。芽孢杆菌属（Bacillus）的许多菌株在 PGPR 应用中表现突出，其中解淀粉芽孢杆菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）是备受关注的 PGPR，它们能在植物根部形成生物膜，并产生生物活性化合物抑制病原菌生长。

生物防治活性依赖于细菌在植物根部的定殖能力和合成抗菌化合物的能力。此前研究虽已明确芽孢杆菌对根际分泌物的转录反应、运动性和生物膜形成在根部定殖中的重要作用，以及介导病害抑制的抗菌次生代谢物，但这些过程的调控机制仍不清晰。胞外功能（Extracytoplasmic function，ECF）σ 因子是芽孢杆菌中的重要转录调节因子，参与应对多种压力。在枯草芽孢杆菌（B. subtilis）中，ECF σ 因子与生物膜形成等过程密切相关，然而解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）中 ECF σ 因子在生物膜形成和生物防治中的作用尚不明确。因此，开展此项研究以深入探究解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）118 中 ECF σ 因子的功能，对揭示生物防治的调控机制至关重要。

研究方法

1. 拮抗菌株的分离：从中国广州香蕉植株根际土壤（23? 08’ N 113? 16’ E）采集样本，经震荡、加热、稀释后在溶原肉汤（Lysogeny broth，LB）平板上分离芽孢杆菌属菌株，纯化后用 15% 甘油制备冻存管，于 - 80 °C 保存。

2. 抗菌活性测试：采用平板对峙法和点种法，测试菌株 118 及其突变体对常见真菌病原体的抗真菌活性；利用优化的点种法评估其对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）GMI1000 的抗菌活性。在平板对峙法中，针对不同真菌选择合适培养基培养，将含有真菌的菌丝琼脂块或菌丝置于平板特定位置，接种解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）118 菌液，培养后测量抑菌圈直径；点种法中，制备真菌孢子悬液与软琼脂混合倒平板，接种菌液后同样测量抑菌圈直径评估抗真菌活性。抗菌活性测试同理，只是针对的是青枯雷尔氏菌（R. solanacearum） 。

3. 突变体构建：确定 118 对多种抗生素的敏感性后，通过长侧翼同源 PCR（Long flanking homology PCR，LFH-PCR）和寡核苷酸引物，用抗生素抗性盒替换编码区域，构建解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）118 背景下的多个单突变体；在枯草芽孢杆菌（B. subtilis）3610 背景下构建 sigX::erm 突变体和 PspecsigX 互补菌株，所有构建体经桑格测序验证。

4. 全基因组测序与分析：提取 HB19118 菌株的基因组 DNA，使用牛津纳米孔和 Illumina 技术的混合系统进行全基因组测序，将序列数据提交至 NCBI。基于全基因组序列，利用类型菌株基因组服务器（Type Strain Genome Server，TYGS）进行分类学分析，通过 FastANI 计算与其他菌株的平均核苷酸同一性，使用 antiSMASH 预测次生代谢物生物合成基因簇。

5. 运动性和生物膜形成测定：采用标准协议稍作修改，测试菌株的群集和游泳运动性；通过监测菌落形态和空气 - 液体界面的菌膜形成，评估生物膜形成能力，其中菌膜形成实验中，接种菌液于特定培养基，培养后收获菌膜干燥称重。

6. 植物盆栽实验：在温室条件下，以香蕉枯萎病和番茄青枯病为研究对象，设置不同处理组，监测香蕉和番茄植株的病情指数（Wilt severity index，WSI）和发病率（Wilt incidence，WI），计算生物防治效果。

7. 根部定殖和细胞回收计数：以拟南芥为材料，接种菌株后在不同时间点处理根部，通过共聚焦扫描激光显微镜观察根部定殖情况；将处理后的根部清洗、研磨、稀释后涂布平板，计算每毫米根的菌落形成单位（Colony forming units，CFU）。

8. 脂肽提取与分析：从抑制区提取脂肽（Lipopeptide，LP），用乙腈 / 水混合液处理后，通过反相超高效液相色谱 - 串联质谱（UPLC - MS）进行鉴定和定量分析。

研究结果

1. 解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）118 对 Foc 具有强拮抗活性：从广州香蕉根际土壤分离出 60 多株芽孢杆菌，菌株 118（HB19118）对香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f sp. cubense，Foc）抑制效果最强。在点种实验中，118 处理组的抑菌圈直径为 8.8 ± 0.5 mm，且使 Foc 孢子和菌丝形态改变。全基因组测序显示，118 与解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）FZB42 聚类紧密。此外，118 对稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、荔枝霜疫霉（Peronophythora litchii）等多种真菌也有显著抑制作用。

2. 解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）118 有效防治香蕉枯萎病：温室盆栽实验表明，与未处理的对照组（CK2）相比，118 处理组香蕉植株枯萎发病率降低近两倍，植株叶片数、株高和生物量显著恢复，接近健康对照组（CK1）水平，同时 118 处理使根际微生物群落得到恢复，细菌和放线菌数量增加，真菌数量显著减少，说明 118 能有效抑制香蕉枯萎病，恢复土壤微生物生态平衡。

3. sigX 缺失影响解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的生物膜发育：解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）118 生物膜形成能力强于其他菌株。构建解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）118 的 ECF σ 因子单突变体后发现，sigX::erm 突变体的菌膜结构变薄、紊乱，菌落形态也受到破坏，生物膜质量显著降低。在枯草芽孢杆菌（B. subtilis）3610 中，sigX 缺失同样导致生物膜形成受阻，且该表型可通过互补恢复，表明 σx 在维持生物膜结构完整性中起关键作用。此外，sigX 突变体在根部定殖能力上有所下降，但游泳和群集运动性仅有轻微缺陷，脂肽产量无差异。

4. σx 增强解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）118 的生物防治效果：在香蕉枯萎病和番茄青枯病盆栽实验中，缺失 sigX 导致解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）118 对 Foc 和青枯雷尔氏菌（R. solanacearum）的生物防治效果显著降低。在香蕉枯萎病实验中，野生型 118 处理组的发病率为 23%，生物防治效果为 65%，而 sigX::erm 突变体处理组发病率为 38%，生物防治效果为 42%；在番茄青枯病实验中，野生型 118 处理组发病率为 51%，sigX::erm 突变体处理组发病率为 69%，凸显了 σx 在生物防治中的重要作用。

研究结论与讨论

本研究表明，解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）118 对香蕉枯萎病菌（Foc）和番茄青枯病菌（R. solanacearum）具有显著的生物防治活性。胞外功能 σ 因子 σx 在解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）118 的生物膜形成和生物防治过程中发挥关键作用，缺失 sigX 导致生物膜形成能力下降，进而降低了对植物病原菌的抑制效果。

芽孢杆菌属作为植物根际促生菌，其促进植物生长和抑制病害的机制复杂。在根际环境中，芽孢杆菌感知根际分泌物中的化学物质，通过趋化作用向根部迁移，进而形成生物膜，生物膜不仅能物理阻挡病原菌侵染，还为芽孢杆菌提供适宜的生存微环境。同时，芽孢杆菌产生的抗菌化合物也能抑制病原菌生长。然而，这些过程的遗传调控网络尚未完全明晰。

在本研究中，虽然明确了 σx 对生物膜形成和生物防治的重要性，但具体的调控机制仍有待深入探究。推测 σx 可能通过激活 abh 基因表达促进生物膜形成，因为解淀粉芽孢杆菌（B. velezensis）118 中 abh 基因的启动子与枯草芽孢杆菌（B. subtilis）168 中相似，且可能依赖于 σx。此外，σx 调控子可能在病害抑制中发挥更多作用，如激活抗生素合成和抗性基因，参与根际微生物群落的调节等。

本研究为芽孢杆菌作为生物防治剂的应用提供了重要的理论依据，揭示了 σx 在生物膜形成和生物防治中的关键作用，有助于深入理解芽孢杆菌生物防治的分子机制。未来研究可进一步探究 σx 调控的下游基因和信号通路，以及不同环境条件下 σx 的功能变化，为开发更高效的生物防治策略提供更坚实的基础，推动农业可持续发展。