基于细胞c-Fos表达的全脑成像的致幻剂和精神活性药物分类

　　

基于全脑细胞 c-Fos 表达成像对迷幻剂和精神活性药物的分类

摘要：裸盖菇素（Psilocybin）、氯胺酮（Ketamine）和 3,4 - 亚甲基二氧甲基苯丙胺（MDMA）是具有行为效应的精神活性化合物，其效应既有区别又有重叠。由于对使用这些化合物作为治疗药物的兴趣日益增加，开发能够准确筛选迷幻剂及其相关类似物的临床前检测方法变得十分必要。美国康奈尔大学迈纳生物医学工程学院（Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University）的研究人员提出，一种有前景的方法是测量药物对天然脑组织中神经可塑性标记物的作用。因此，他们开发了一种利用光片荧光显微镜在细胞分辨率下对即刻早期基因表达进行成像，然后结合机器学习的药物分类流程。研究人员用一组药物对雄性和雌性小鼠进行了测试，这些药物包括裸盖菇素、氯胺酮、5 - 甲氧基 - N,N - 二甲基色胺（5-MeO-DMT）、6 - 氟 - N,N - 二乙基色胺（6-fluoro-DET）、MDMA、急性氟西汀（acute fluoxetine）、慢性氟西汀（chronic fluoxetine）以及生理盐水（vehicle）。在一对多分类中，该方法识别具体药物的准确率达到 67%，显著高于 12.5% 的随机水平。在一对一分类中，裸盖菇素与 5-MeO-DMT、氯胺酮、MDMA 或急性氟西汀区分的准确率超过 95%。研究人员使用 Shapley 可加性解释（Shapley additive explanation）来确定驱动机器学习预测的脑区。这些结果表明，这是一种用于表征和验证具有迷幻特性的精神活性药物的独特方法。

一、引言

迷幻剂包括经典的血清素能迷幻剂，如裸盖菇素和 5 - 甲氧基 - N,N - 二甲基色胺（5-MeO-DMT），以及相关的精神活性化合物，如氯胺酮和 3,4 - 亚甲基二氧甲基苯丙胺（MDMA）。近年来，这些化合物作为神经精神疾病潜在治疗药物受到广泛关注。在心理支持下使用裸盖菇素治疗重度抑郁症和难治性抑郁症的研究正在积极开展。亚麻醉剂量的氯胺酮治疗抑郁症和创伤后应激障碍（PTSD）的疗效也经过了长期研究，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准艾司氯胺酮鼻喷雾剂用于治疗难治性抑郁症。此外，MDMA 辅助心理治疗针对中重度 PTSD 的 Ⅲ 期临床试验也已开展。这些临床应用引发了人们对了解这些化合物作用机制的共性与差异的浓厚兴趣。

除了已知的迷幻剂，合成受迷幻剂启发的新型类似物也备受关注，这些类似物有望成为新型治疗药物。理想情况下，新化合物应保留治疗效果，同时改善药代动力学特性，减少感知效应并消除心血管风险。然而，这一研究的主要障碍在于开发有效的筛选方法，能够从数千种受迷幻剂启发的类似物中筛选出最具潜力的化合物，以便进一步深入研究。目前，大多数筛选方法主要在分子或行为层面进行。在分子层面，候选化合物可以通过计算机模拟与 5-HT2A 受体结构对接，然后通过生化方法测量受体结合以及下游 G 蛋白和 β-arrestin 通路的激活情况。这种基于靶点的方法虽然取得了一些有前景的成果，但它假设 5-HT2A 受体是治疗效果的关键介导因素，这一点尚未得到确凿证明。在行为层面，候选化合物在动物身上进行特定表型测试。简单的行为特征，如动物运动模式的变化，可以通过自动化手段提高测试通量和准确性。然而，与抑郁症相关的更复杂行为测试存在局限性，包括结构效度差和对药物在人体中疗效的预测能力较弱。

开发一种新的筛选方法可以补充当前的分子和行为学方法，加速临床前药物研发。经典迷幻剂和氯胺酮都具有增强大脑神经可塑性的能力，例如，单剂量的氯胺酮、裸盖菇素以及相关的血清素能受体激动剂可使啮齿动物内侧前额叶皮质中的树突棘快速且持续生长。因此，一种有前景的方法是聚焦于量化天然脑组织中神经可塑性的指标。即刻早期基因会在细胞受到放电活动增加或外部刺激时被激活，是神经可塑性的关键部分，因为它们能够通过调节基因表达使神经元适应刺激，这对于突触修饰和学习所需的蛋白质合成至关重要。以经典迷幻剂为例，给药后会诱导即刻早期基因（包括 c-Fos）的表达显著增加，在多个脑区中，短至 30 分钟即可检测到这种变化。近年来，组织透明化、光片荧光显微镜以及细胞核自动检测技术的进步，使得在全小鼠脑内高通量绘制 c-Fos 等即刻早期基因的表达图谱成为可能。美国康奈尔大学迈纳生物医学工程学院的研究团队和其他研究人员已应用该方法来表征裸盖菇素和氯胺酮的作用，越来越多的研究开始利用全脑荧光信号成像来研究药物。尽管这些早期研究提供了有价值的生物学见解，但到目前为止，每项研究通常仅纳入一两种药物。要将该方法发展为一种药物筛选工具，需要在更大范围的化合物上评估其可行性和准确性。

在本研究中，美国康奈尔大学迈纳生物医学工程学院的研究人员测量了雄性和雌性小鼠在 8 种药物处理条件下的全脑 c-Fos 表达情况，这些药物包括多种迷幻剂、相关精神活性化合物以及生理盐水对照。他们开发了一种基于可解释机器学习的分析和分类流程，并在一对多和一对一分类任务中评估其性能。研究人员还使用 Shapley 可加性解释来解读机器学习模型，以确定驱动分类的脑区。总体而言，这些结果表明，全脑即刻早期基因表达成像有望成为临床前药物研发的有效方法。

二、研究结果

2.1 研究中的迷幻剂和相关药物

在本研究中，研究人员评估了 8 种药物处理条件：裸盖菇素（PSI，1mg/kg，腹腔注射，单剂量）、氯胺酮（KET，10mg/kg，腹腔注射，单剂量）、5 - 甲氧基 - N,N - 二甲基色胺（5-MeO-DMT 或 5-MEO，20mg/kg，腹腔注射，单剂量）、6 - 氟 - N,N - 二乙基色胺（6-fluoro-DET 或 6-FDET，20mg/kg，腹腔注射，单剂量）、3,4 - 亚甲基二氧甲基苯丙胺（MDMA，7.8mg/kg，腹腔注射，单剂量）、急性氟西汀（A-SSRI，10mg/kg，腹腔注射，单剂量）、慢性氟西汀（C-SSRI，10mg/kg，腹腔注射，每天一次，持续 14 天）以及生理盐水（SAL，10mL/kg，腹腔注射，单剂量）。

研究人员选择这些化合物进行研究有多个原因。裸盖菇素是一种经典的迷幻剂，作用于 5-HT2A 受体，目前正处于评估迷幻剂治疗抑郁症疗效的后期临床试验前沿。氯胺酮主要是一种 N - 甲基 - D - 天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，尽管其与裸盖菇素的分子靶点不同，但在促进神经可塑性和行为效应方面存在相似之处，因此是与裸盖菇素进行对比研究的有趣化合物。裸盖菇素和氯胺酮的剂量及给药途径是根据先前在小鼠中显示出行为效应的研究确定的。

5-MeO-DMT 是与裸盖菇素属于同一色胺化学类别的经典血清素能迷幻剂，临床研究对其治疗抑郁症的潜力很感兴趣。在小鼠中，20mg/kg 的 5-MeO-DMT 可诱导头部抽搐反应，并引起小鼠内侧前额叶皮质的结构重塑。与裸盖菇素相比，5-MeO-DMT 作用时间更短，且对 5-HT1A 受体的亲和力高于 5-HT2A 受体，因此是另一种具有不同药代动力学和受体靶点特征的色胺类迷幻剂的典型例子。6-fluoro-DET 也是一种与裸盖菇素和 5-MeO-DMT 类似的色胺类化合物，虽然它在脑内具有生物利用度且是 5-HT2A 受体激动剂，但在人体中仅诱导自主神经效应而不引起感知变化，因此在一项临床研究中被用作活性、非致幻性对照。与此一致的是，6-fluoro-DET 在训练大鼠区分麦角酸二乙酰胺（LSD）或 2,5 - 二甲氧基 - 4 - 碘苯丙胺（DOI）的实验中作为替代化合物无效。为了证实先前的这些结果，研究人员使用磁性耳标自动检测小鼠头部运动，测量了 6-fluoro-DET 对小鼠头部抽搐反应的影响。结果显示，与 1mg/kg 的裸盖菇素和 20mg/kg 的 5-MeO-DMT 引发强烈的头部抽搐反应不同，给予 20mg/kg 6-fluoro-DET 的小鼠与对照组在统计学上无差异。该研究与其他近期研究一样，将 6-fluoro-DET 作为非致幻性色胺类化合物进行比较，其剂量选择与 5-MeO-DMT 相同。

MDMA 与裸盖菇素不同，它属于苯乙胺化学类别，具有独特的促社交和欣快感特质。MDMA 可作用于单胺转运体，增强包括血清素在内的神经调节剂的释放并抑制其再摄取，因此被归类为 “情绪增强剂（entactogen）” 而非经典的血清素能迷幻剂。MDMA 在临床上与 PTSD 的治疗密切相关，研究人员根据先前研究中该剂量可促进小鼠恐惧消退学习的结果，选择 7.8mg/kg 作为 MDMA 的测试剂量。氟西汀是一种常用的抗抑郁药，属于选择性血清素再摄取抑制剂（SSRI）。临床研究关注的是了解 SSRI 与裸盖菇素的相对疗效，以及氯胺酮或裸盖菇素是否适用于治疗难治性抑郁症。由于 SSRI 需要长期给药才能发挥治疗效果，其作用机制可能与裸盖菇素和氯胺酮不同。基于这些原因，研究人员在本研究中纳入了急性和慢性氟西汀，剂量选择为先前在小鼠研究中使用过的 10mg/kg。对照组动物接受单剂量生理盐水注射。

2.2 细胞 c-Fos 表达的光片荧光成像

对于 8 种药物中的每一种，研究人员分别测试了 4 只雄性和 4 只雌性 C57BL/6J 小鼠，整个数据集共涉及 64 只动物。在单剂量给药后 2 小时或慢性氟西汀最后一次给药后 2 小时采集小鼠大脑样本。选择 2 小时的时间间隔是假设药物在 0.5 小时内穿透进入大脑，并在随后 1.5 小时达到 c-Fos 表达峰值。大脑样本经过组织透明化和 c-Fos 免疫组织化学处理。使用光片荧光显微镜对每个大脑进行成像，在 x 和 y 轴上的分辨率为每像素 1.8μm，在 z 轴上的间隔为 4μm，这样可以对整个大脑中的所有细胞进行无间隙采样。通过神经网络自动检测与 c-Fos 阳性细胞对应的荧光斑点来分析图像。图 1e 展示了每种处理条件下每个大脑中检测到的 c-Fos 阳性细胞数量，图 1f 展示了一只接受裸盖菇素处理的小鼠大脑的荧光图像示例。

为了研究 c-Fos 阳性细胞的区域分布，研究人员将每个大脑的图像与艾伦脑图谱（Allen Brain Atlas）进行配准，并根据艾伦小鼠脑通用坐标框架将图像分割为汇总结构。所有动物每个脑区的 c-Fos 阳性细胞数量作为源数据提供。为了直观展示整个数据集，研究人员将每个脑区的 c-Fos 阳性细胞计数除以每个大脑的 c-Fos 阳性细胞总数以及该脑区的空间体积进行归一化处理。图 2 是所有样本的 c-Fos 阳性细胞密度热图，可以观察到 c-Fos 阳性细胞密度在大脑皮层、嗅区、海马区、纹状体和苍白球以及丘脑普遍较高，而在中脑、后脑和小脑中表达较低。同一药物处理的样本之间存在个体差异，不同药物之间也有显著差异。这就引出了一些问题，例如：个体差异与药物间差异相比如何？全脑 c-Fos 图谱在区分不同药物方面的效果如何？

2.3 基于全脑 c-Fos 分布的药物分类机器学习流程

为了回答这些问题，研究人员开发了一种用于定量比较不同药物处理条件下全脑 c-Fos 表达数据的流程。他们认为不同化合物可能会引发细胞 c-Fos 表达的不同区域分布，这些分布可作为药物分类的 “指纹”。该流程首先构建一个包含不同样本不同脑区 c-Fos 阳性细胞计数的矩阵。这个矩阵中的 c-Fos 阳性细胞计数数据需要进行预处理，首先进行归一化处理，即将每个区域的 c-Fos 阳性细胞计数除以大脑的总 c-Fos 阳性细胞计数，以减少样本间的批次效应。然后，使用 Yeo-Johnson 变换（一种使用幂函数对数据进行单调变换的方法）和稳健缩放（减去中位数并按四分位数间距缩放）对数据进行处理，使不同脑区的值更具可比性，便于拟合机器学习模型，经过预处理后的数据值称为 c-Fos 分数。

接下来，研究人员采用 Boruta 特征选择程序来确定用于模型拟合和测试的脑区。Boruta 程序是一种基于排列的特征重要性确定方法，它通过创建 “影子特征” 来实现。例如，如果数据包含不同条件下脑区 1 的 48 个 c-Fos 分数，那么相应的影子特征就是将这 48 个 c-Fos 分数的药物标签打乱后的结果。为所有脑区创建影子变量以构建扩展的 Boruta 数据集，然后使用该数据集训练随机森林分类器，以确定每个脑区的特征重要性值。如果一个脑区的特征重要性值高于影子特征的最大特征重要性值，则该脑区被视为 “命中”。这个排列过程重复 100 次，由于每个脑区在每次迭代中只有 “命中” 或 “未命中” 两种结果，因此所有迭代结果的分布是二项分布，根据超过二项分布第 95 百分位数的统计标准来确定是否纳入某个脑区。研究人员使用 Boruta 程序而不是纳入所有脑区，是因为许多脑区可能对区分药物作用贡献很小或没有贡献，将它们纳入模型会增加噪声并导致过拟合。Boruta 的一个显著优点是脑区之间不相互竞争，而是与影子特征竞争，因此最终选择的脑区数量不是预先确定的，而是由数据决定。

在最后一步，使用选定脑区的 c-Fos 分数构建岭逻辑回归模型。整个流程使用四折交叉验证进行评估，即每种药物条件下 75% 的数据用于训练和拟合模型，剩余 25% 的数据用于测试模型。重要的是，研究人员仅使用训练数据来优化预处理参数、进行特征选择并构建回归模型，然后将相同的优化参数和选定特征应用于测试数据，以确保没有数据泄露。交叉验证过程重复 100 次，以评估该流程的预测准确性。

2.4 一对多分类显示药物预测准确率远高于随机水平

在预处理步骤之后，研究人员对所有 64 个样本的 c-Fos 分数进行线性判别分析，并绘制前两个线性判别数据。该可视化结果清楚地表明，不同药物之间 c-Fos 分数的差异比同一药物条件下不同样本之间的差异更易于区分。通过不同作用机制改变血清素能的药物在第一个线性判别轴上的位置不同，而 5-MeO-DMT、6-fluoro-DET 和裸盖菇素在第二个线性判别轴上可区分。

研究人员首先使用整个数据集测试该流程，并让模型预测具体的药物处理条件。混淆矩阵展示了预测的药物标签与真实药物标签的对比情况。由于有 8 种条件，随机猜测的准确率为 12.5%（1/8）。研究人员发现，模型在识别 MDMA、慢性氟西汀和 5-MeO-DMT 样本时准确率最高，分别为 100%、89% 和 81%。其他条件下的性能较低，所有药物的总体平均准确率为 67%，生理盐水和急性氟西汀的准确率最低，分别为 38% 和 47%。研究人员认为，出现低准确率情况是因为在解决这个 8 分类问题时需要进行权衡。机器学习模型使用交叉熵损失函数，其目的是最大化整个训练集上正确标记训练数据的概率，而不是以一对一的方式划分边界。在这种全局方法中，个体决策边界的设置可能会使某个标签（如生理盐水）的分类性能提升，但同时导致其他标签的性能下降。换句话说，模型的训练目标是最大化总体平均分类准确率，这并不一定是区分任何一个特定条件（如生理盐水）的最佳方式。尽管如此，67% 的平均准确率仍然显著高于 12.5% 的随机水平。

混淆矩阵是基于单一决策阈值计算的，这可能会夸大一种药物类型的真阳性率，同时增加另一种药物类型的假阳性率。为了从不同角度了解模型性能，研究人员绘制了精确率 - 召回率曲线。这些曲线考虑了所有可能的决策阈值下的性能，并以精确率（真阳性与假阳性的比例）和召回率（真阳性与假阴性的比例）来总结结果。完美分类器的精确率 - 召回率曲线下面积（precision-recall AUC）为 1。在所有药物中，该流程产生的平均精确率 - 召回率曲线下面积值为 0.75，远高于 8 种药物中随机猜测的理论值 0.125 以及使用打乱数据计算的经验值 0.12。基于精确率 - 召回率曲线下面积预测不同药物的性能排名与混淆矩阵中的准确率排名一致。总体而言，这些结果证明了全脑 c-Fos 图谱可用于从一组相关精神活性化合物中识别所给予的具体药物。

该流程的一个可能应用场景是根据 c-Fos 表达模式确定一种新型化学实体在药理学空间中的位置。为了模拟这种情况，研究人员进行了留一药分析，即使用 7 种条件（裸盖菇素、氯胺酮、5-MeO-DMT、MDMA、急性氟西汀、慢性氟西汀和生理盐水）训练模型，然后在包括 6-fluoro-DET 在内的所有条件下进行测试。研究人员发现，6-fluoro-DET 最常被归类为裸盖菇素