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为解决细胞内货物运输中驱动蛋白数量与货物速度关系不明确的问题，国立中央大学的研究人员开展了 “Multiple kinesins speed up cargo transport in crowded environments by sharing load” 的研究，发现货物速度受驱动蛋白数量和拥挤剂大小影响，对理解细胞运输机制意义重大，推荐阅读。
国立中央大学（National Central University）物理系及复杂系统中心的研究人员 Ya-Ting Huang 等人在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “Multiple kinesins speed up cargo transport in crowded environments by sharing load” 的论文。这篇论文对于深入理解细胞内物质运输机制有着重要意义，为生命科学领域研究分子马达在复杂细胞环境中的功能提供了新的视角和理论依据。
摘要解读
细胞内物质运输依赖于分子马达，驱动蛋白（kinesin）是其中重要一员。以往研究虽知货物（cargo）常由多个驱动蛋白运输，且驱动蛋白数量影响货物运输距离，但难以确定某一时刻移动货物的驱动蛋白数量，在拥挤细胞质环境下，货物速度与驱动蛋白数量的关系也尚无定论。本研究中，研究人员采用非侵入性方法量化瞬时驱动蛋白数量，探究拥挤环境对多个驱动蛋白运输货物运动的影响。实验表明，货物速度取决于驱动蛋白数量和拥挤剂（crowder）大小。研究还发现驱动蛋白张力在集体运动中起作用，这一结论通过随机驱动蛋白模拟得到证实。该研究展示了非侵入性方法在确定参与运动的驱动蛋白数量方面的广泛适用性，揭示了大分子拥挤、驱动蛋白张力和驱动蛋白介导的货物运输之间的复杂相互作用。
研究背景
真核细胞的正常功能依赖于细胞内运输，货物的移动是细胞运输的关键环节，由驱动蛋白 1 - 3 等分子马达推动。驱动蛋白通过 ATP 水解提供能量，进行连续性运动，每次向细胞周边移动 8 纳米。它们协同工作，将细胞货物运输得更远，并克服阻碍货物前进的障碍。此前众多体外实验利用 DNA 支架或抗体研究驱动蛋白的集体运动，发现货物速度与驱动蛋白数量无关，但这与细胞内观察到的多样速度分布相矛盾。细胞内部的一个关键特征是存在大分子拥挤现象，细胞内 30 - 40% 的体积被大分子和小分子化合物占据，形成高度结构化的环境。这种现象对多种生化过程产生显著影响，包括结合速率和酶活性的改变，细胞内运输也受到大分子拥挤的影响。体外实验研究了大分子拥挤剂对驱动蛋白运输货物的影响，对于单个驱动蛋白，拥挤剂会阻碍其运动。然而，对于多个驱动蛋白运输货物的情况，不同研究小组在不同拥挤环境下对货物速度的研究结果存在分歧。例如，在拥挤的牛血清白蛋白（BSA）溶液中，货物速度随驱动蛋白数量增加而降低；在葡聚糖 - 菲柯尔（dextran - Ficoll）溶液中，货物速度与驱动蛋白数量无关；在拥挤的黄原胶（Xanthan gum）溶液中，货物速度随驱动蛋白数量增加而逐渐增加。总体而言，不同环境可能导致货物运输速度不同，为验证这一假设，研究人员开展了此项研究。
研究方法
- 驱动蛋白纯化：从细菌中纯化尾端截断的驱动蛋白 - 1 蛋白（人类普遍存在的驱动蛋白 - 1，KIF5B）。将表达质粒转化到大肠杆菌 BL21（DE3）中，用 0.1 mM IPTG 诱导蛋白表达。通过超声破碎细胞，离心收集上清液，与 Ni - NTA 琼脂糖孵育，再用 500 mM 咪唑洗脱，透析去除咪唑。进一步通过微管亲和纯化去除无活性的运动蛋白。
- 运动分析：驱动蛋白与羧化聚苯乙烯珠在含有 ATP 的珠运动缓冲液中孵育。运动分析缓冲液中添加黄原胶、BSA 或甘油来增加介质的拥挤度。紫杉醇稳定的微管在特定缓冲液中聚合，实验在流动通道中进行，微管固定在经聚赖氨酸处理的盖玻片表面，注入结合驱动蛋白的珠子后密封通道。
- 显微镜系统与光镊：利用光镊捕获并移动粒子靠近微管，980 nm 单模光纤耦合二极管激光器通过 100X 油浸物镜聚焦在显微镜样品平面上产生梯度力。光镊的捕获力通过位置敏感装置测量，陷阱刚度通过两种方法校准。实验中保持陷阱刚度足够小，使驱动蛋白能脱离陷阱并沿微管自由移动。利用差分干涉对比显微镜结合光镊观察珠子运动，并用 sCMOS 相机以 100 Hz 的帧率记录，通过自制的 LabVIEW 软件确定粒子位置并转换坐标。
- 黄原胶缓冲溶液制备：制备黄原胶母液，溶解后离心过滤去除不溶物，透析后储存。实验中从母液稀释得到 20% - 60% 浓度的溶液，通过测量 500 nm 珠子的均方位移确定不同浓度黄原胶溶液的拖曳系数（drag coefficient，Γ）。
- 拖曳系数测量：通过单粒子追踪实验测量黄原胶溶液的拖曳系数。记录 500 nm 羧化粒子的轨迹，根据自由扩散粒子的轨迹估计二维均方位移。由于粒子靠近表面会增加有效粘度，根据法森定律（Faxen’s law）对测量值进行校正，得到用于驱动蛋白实验的有效拖曳系数。
- 确定驱动蛋白数量的理论模型：运用涨落定理（fluctuation theorem，FT）确定参与货物运输的驱动蛋白数量。根据涨落定理，将正向和反向涨落的概率与系统的热力学性质相关联，对于货物运动可改写为特定公式。通过定义涨落程度 χ，当货物位移的概率分布近似为高斯分布时，可进一步简化 χ 的表达式。在较大时间尺度下，χ 收敛到一个常数，该常数与驱动蛋白施加的力相关，且假设与驱动蛋白数量成正比，从而可用于识别参与运输的驱动蛋白数量。
- 驱动蛋白两态模型模拟：基于两态模型，采用蒙特卡罗方法（Monte Carlo approach）对驱动蛋白在微管上的行走进行模拟。考虑驱动蛋白从一种状态到另一种状态的转换速率，以及向前和向后的步进速率，这些速率与施加的力有关。通过朗之万动力学（Langevin dynamics）模拟货物运动，连接动力学驱动蛋白模型和货物，使用特定参数进行数值模拟，模拟结果与理论预测相符。
研究结果
- 多个驱动蛋白拖动货物的速度分布：使用黄原胶聚合物作为拥挤剂增加驱动蛋白检测缓冲液（KAB）的复杂性，控制黄原胶浓度（XKAB）研究拥挤剂浓度对货物速度的影响。实验在流动通道中进行，通道内表面涂有微管，调整珠子与驱动蛋白的比例，但特定珠子上的驱动蛋白数量未知。当用光学镊子将带有驱动蛋白的粒子带到微管上时，驱动蛋白会结合并沿微管线性移动。实验结果显示，多个驱动蛋白可使货物移动较长距离。为进一步分析，去除速度小于 200 nm/s 的轨迹。
- 识别参与货物运输的驱动蛋白数量：货物速度的广泛分布源于多个驱动蛋白的集体运动，但通常难以确定参与货物运输的驱动蛋白数量 N。研究人员采用基于涨落定理的非侵入性技术来识别运输过程中参与的驱动蛋白数量。通过分析货物轨迹的位移概率分布，确定涨落程度 χ。当 χ 在足够大的时间间隔（约≥150 ms）收敛到一个常数时，对单个轨迹的 χ 在饱和时间间隔内取平均，得到饱和涨落单位 χ*。χ* 直方图中在 0.1 左右的整数倍处出现峰值，对应驱动蛋白数量的识别特征，这与其他关于驱动蛋白和动力蛋白（dynein）的实验结果一致。
- 驱动蛋白分担负载以快速移动：确定不同数量驱动蛋白在不同浓度 XKAB 下货物的平均速度 vh i。在 0% XKAB 中，vh i 保持恒定，为 780 nm/s，与货物上的驱动蛋白数量无关，但每个货物的速度 v 分布广泛。在 60% XKAB 环境中，单个驱动蛋白时货物速度约为 700 nm/s，随着驱动蛋白数量增加，速度逐渐增加。研究还发现，对于单个驱动蛋白，拥挤度增加时货物速度降低；对于多个驱动蛋白，货物速度随拥挤度增加而升高并达到饱和。这可以用负载分担模型解释，即货物上的负载由每个参与的驱动蛋白平均分担。研究人员还研究了拥挤剂分子大小对多个驱动蛋白拖动货物运动的影响，发现较小的拥挤剂（如 BSA 和甘油）会使货物速度减慢且与浓度无关，而较大的拥挤剂（如 XKAB）虽使货物负载增加，但不会直接干扰单个驱动蛋白运动，多个驱动蛋白可共同分担负载，表明分子大小是影响货物速度的因素之一。通过朗之万动力学模拟进一步验证，随着驱动蛋白数量增加，货物平均速度增加，且在高拖曳系数（高拥挤度）情况下，单个驱动蛋白的负载降低。
- 货物运动的数值模拟：通过朗之万动力学模拟货物运动，连接动力学驱动蛋白模型和货物。模拟结果显示，在低拖曳系数下，单个驱动蛋白拖动的货物围绕驱动蛋白位置波动，热运动可克服粘性阻力；高拖曳系数下，货物总是落后于驱动蛋白且移动缓慢。对于五个驱动蛋白拖动货物的情况，低拖曳系数时货物波动较小，驱动蛋白分布在货物周围；高拖曳系数时，所有驱动蛋白伸展以拉动货物。通过线性拟合货物轨迹确定速度，模拟结果与实验结果相符，即在低拖曳系数下，平均速度 vh i 恒定；在高拖曳系数下，单个驱动蛋白拉动的货物速度缓慢，随着驱动蛋白数量增加，速度增加并渐近接近 v0。研究人员还检查了运输过程中驱动蛋白的拉伸情况，发现随着拥挤剂浓度增加，单个驱动蛋白长度分布的峰值向右移动，表明弹性力增加；多个驱动蛋白时情况类似，但高浓度下驱动蛋白长度比低浓度时短，即单个驱动蛋白的负载降低。
研究结论与讨论
研究人员测量了不同数量驱动蛋白在不同分子大小拥挤剂溶液中运输货物的速度，发现两种与驱动蛋白数量相关的速度变化趋势。在小拥挤剂（如 BSA 或甘油）溶液中，无论驱动蛋白数量多少，货物速度均低于无拥挤剂溶液，这是因为小拥挤剂直接影响驱动蛋白运动。而较大的拥挤剂（黄原胶）不会直接影响驱动蛋白运动，仅与货物相互作用，货物速度随驱动蛋白数量增加而增加。单个驱动蛋白施加的平均拖曳力或单个驱动蛋白拉伸产生的力与单个驱动蛋白在外部力作用下运输货物的速度曲线重合，表明驱动蛋白通过分担货物负载来加快运输速度。这一发现与之前认为多个驱动蛋白无法协同产生对抗负载的力的观点相矛盾，但与细胞内的一些研究结果相符，差异可能源于周围介质的拥挤程度不同。多个驱动蛋白集体运动的确切机制仍在探索中，驱动蛋白柄部的张力可能在协调多个驱动蛋白的运动中发挥作用。多个驱动蛋白在拥挤环境中运输货物的速度分布比单个驱动蛋白更宽，但仍比细胞内货物速度分布窄，这表明还有其他因素影响细胞内运输的复杂性，如不同类型驱动蛋白速度不同、微管异质性、通过衔接蛋白对货物的特异性调节、细胞拥挤和障碍物影响运动以及动态细胞信号通路调节驱动蛋白活性等。进一步的体外实验考虑这些因素，将有助于更好地理解分子马达在拥挤细胞环境中的功能。
这项研究展示了如何利用涨落定理瞬时提取移动货物的驱动蛋白数量，揭示了蛋白质、拥挤剂和货物运输之间的复杂相互作用，为深入理解分子马达在拥挤条件下的功能提供了重要依据。驱动蛋白柄部张力是这些分子马达的一个有趣特征，它有助于多个驱动蛋白协同工作和分担负载，确保细胞内高效有力的货物运输。
