靶向癌症治疗新突破：解析 Brachyury 与 DNA 识别结构及发现潜在治疗结合物

为解决 Brachyury 难以成药的问题，牛津大学药物发现中心研究人员开展 Brachyury 靶向研究。他们解析其与 DNA 结合结构、筛选结合片段，获得低 μM 结合力化合物。这为癌症治疗提供新思路，强烈推荐科研读者阅读。

　　

牛津大学药物发现中心（Centre for Medicines Discovery, University of Oxford）的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Structural insights into human brachyury DNA recognition and discovery of progressible binders for cancer therapy” 的论文。这篇论文在癌症治疗领域意义重大，为针对特定癌症的靶向治疗提供了全新的思路和潜在方案，有望推动相关癌症治疗药物的研发进程。

研究概述

论文旨在探究小分子能否直接靶向转录因子 Brachyury（编码基因为 TBXT，也被称为 T），为癌症治疗寻找新的突破点。Brachyury 在罕见骨癌脊索瘤（chordoma）的肿瘤生长中起着关键作用，并且与其他实体瘤也存在关联。由于它在健康组织中表达极少，因此成为极具潜力的治疗靶点。然而，作为无配体转录因子，Brachyury 传统上被认为难以成药，这主要是因为其缺乏可结合小分子的口袋，且 DNA 结合界面具有极性。本研究通过解析 Brachyury 与 DNA 结合的结构，并进行晶体片段筛选，发现了可与 Brachyury 结合的小分子，为后续开发针对 Brachyury 的癌症治疗药物奠定了基础。

研究背景

T-box 家族转录因子在人类中包含 18 个成员，在多种动物物种中都存在。它们在细胞发育过程中扮演着重要角色，既可以作为转录激活因子，也能充当转录抑制因子，对多种细胞类型的发育至关重要。这些基因编码一个约 200 个氨基酸的高度保守的序列特异性 DNA 结合域和一个位于 C 端的转录调节域。T-box 蛋白识别一个共同的共有序列 ——T-box 结合元件（T-box binding element，AGGTGTGAAA），不过不同家族成员对重复序列、方向（反向或串联）以及这些重复序列的间距存在偏好差异。目前，人们还不太清楚这些偏好与体内靶基因启动子特异性之间的关系，因为通过染色质免疫沉淀测序（Chip-Seq）分析确定的结合位点通常只显示单个 T-box 元件，其进一步的特异性可能是通过与其他因子的相互作用来实现的。

Brachyury 是 T-box 家族的创始成员，于 1927 年被首次发现。在人类发育第 13 天后，除了少数组织（甲状腺、睾丸和垂体腺）外，Brachyury 的表达水平极低。然而，在多种癌症中却出现了异常表达的情况，其中与脊索瘤的关联最为明确。脊索瘤是一种罕见的癌症，每年每百万人中约有 1 人患病，它沿着脊髓发生，被认为起源于胚胎脊索的残余组织。目前，脊索瘤缺乏有效的靶向治疗方法，主要治疗手段是手术切除，随后辅以放疗和细胞毒性化疗，但复发率较高，患者的中位生存期仅为 7.7 年。TBXT（Brachyury）基因在罕见的家族性脊索瘤和部分散发性脊索瘤（27% 的病例）中总是发生重复。在脊索瘤疾病模型中，该基因对肿瘤生长至关重要，并且通过全基因组 CRISPR-Cas9 筛选发现，它是脊索瘤中最重要的选择性必需基因。此外，在欧洲人群中，一个常见的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs2305089 与患脊索瘤的风险密切相关，该变异导致 Brachyury DNA 结合域中的甘氨酸被天冬氨酸取代（G177D），尽管此前的体外实验表明这种取代会影响 DNA 结合，但目前尚不清楚它在蛋白质功能和脊索瘤发病机制中的确切作用。

除了在脊索瘤中的重要作用外，Brachyury 还参与多种上皮癌的发展，它能够促进肿瘤生长，诱导上皮 - 间质转化（epithelial to mesenchymal transition），进而促使癌细胞从原发肿瘤部位转移。这被认为是由于 E-cadherin 启动子中存在 T-box DNA 结合位点，而 E-cadherin 是细胞黏附的关键参与者。同时，Brachyury 在这些癌症中的表达还与对化疗和放疗的耐药性相关。

总体而言，Brachyury 作为脊索瘤的致癌驱动因子，在健康成人组织中表达极少，是理想的治疗靶点。但由于其自身特性，传统上认为难以用小分子抑制，因此开展针对 Brachyury 的小分子靶向研究意义重大。

研究方法

1. 克隆、表达和纯化：研究人员从北卡罗来纳大学的 Michael Miley 处获得了用于 WT 和 G177D Brachyury DNA 结合域（残基 41 - 224，用于 DNA 复合晶体结构研究）的 pET28 构建体。通过连接非依赖克隆法，将 WT 和 G177D 截短的 DNA 结合域（残基 41 - 211，用于片段筛选晶体研究）构建到 pSUMO-LIC 载体中，以产生带有 N 端 His-SUMO 标签的蛋白质。同时，将全长 WT 和 G177D Brachyury 克隆到 pHGT-Bio 载体中，用于表达带有 N 端 9His-GST 标签和 C 端 AVI 标签的蛋白质，以便在 BirA 酶和生物素存在的情况下进行生物素化标记。所有构建的质粒都已保存在 Addgene 中。
2. 结晶和结构测定：对于 WT Brachyury - DNA 复合物（6F58）的结晶，将自互补 DNA 寡核苷酸加热后缓慢冷却，然后与蛋白质按 1:1.1 的摩尔比混合，使用 Mosquito 结晶机器人进行坐滴气相扩散结晶试验。在 4°C、含有 40% PEG300 和 0.1 M 柠檬酸盐（pH 4.2）的条件下，TBXT 结晶。通过在钻石光源光束线 I04 - 1 收集数据，并使用 PHASER 程序和非洲爪蟾 Brachyury 的结构作为搜索模型进行分子置换来解析结构，最后用 PHENIX REFINE 进行精修。对于 G177D Brachyury - DNA 复合物（6F59）的结晶，采用类似的方法，在不同的结晶条件下（56% MPD，0.1 M SPG pH 6.0）进行，数据处理和结构解析方法与 WT 类似。
3. X 射线片段筛选：在进行 WT Brachyury 片段筛选的结晶时，将蛋白质调整到 7.5 mg/ml，在特定条件下（32% PEG400，0.1 M 醋酸盐 pH 4.5，0.1 M 氯化镉）进行坐滴气相扩散结晶试验。对于 G177D Brachyury 片段筛选的结晶，先在 30% PEG1000，0.1 M SPG pH 7.0 的条件下获得初始种子晶体，再进行后续的结晶操作。将 DSI poised 文库中的片段分别浸泡到 WT 和 G177D 的晶体中，在钻石光源光束线 I04 - 1 收集数据，使用自动化的 XChemExplorer 管道进行处理，通过 PanDDA 程序识别片段命中物，并使用 REFMAC 进行精修。
4. 电泳迁移率变动分析（EMSA）：为了评估 Brachyury 与回文 DNA 序列的结合能力，研究人员设计了一对寡核苷酸，退火后用 T4 多核苷酸激酶和 γ - 32P - ATP 进行标记，然后与不同浓度的蛋白质混合，在特定的缓冲液条件下孵育，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过 BioRad ImageLab 软件对结果进行量化，并使用 Graphpad Prism 绘制图表，计算解离常数。
5. 差示扫描荧光法（DSF）：将全长 WT 和 G177D Brachyury 蛋白稀释到 2 μM，加入 Sypro Orange 染料，在 Mx3005p qPCR 机器上从 25°C 升温到 95°C，以 1°C/min 的速度获取熔解曲线，使用 GraphPad Prism 拟合数据并计算熔解温度（Tm）。
6. RNA 测序分析（RNA - seq analysis）：从 GSE121846 下载 RNA 测序数据，使用 Genialis 平台进行处理。对每个细胞系的 mRNA 编码区域中氨基酸 177 位置的对齐读数进行检查，将 GGU 读数归类为 WT，GAU 读数归类为含有 G177D SNP。对于 CH22 细胞系，采用特定的测序和分析流程进行处理。
7. 基因分型脊索瘤细胞系：从多个脊索瘤细胞系中收集基因组 DNA，通过 PCR 扩增 TBXT 基因外显子 4 两侧的区域，纯化后进行 Sanger 测序，根据测序结果对 WT 和 G177D SNP 进行分类。
8. 表面等离子共振（SPR）：使用 Biacore s200 机器和 Series S SA 传感器表面，将全长生物素化的 G177D 或 WT Brachyury 固定在传感器表面，用含有 T-box 结合位点的回文 DNA 进行滴定，通过拟合二价动力学模型和剂量 - 反应分析来评估 DNA 结合。使用 Biacore 8K + 系统测量小分子与 Brachyury 的结合，将含有 C 端 AVI 标签和生物素化位点的全长人类 Brachyury（G177D）固定在传感器表面，注射不同浓度的化合物，通过剂量 - 反应（平衡）分析评估化合物结合解离常数。

研究结果

1. WT 和 G177D Brachyury 与 DNA 复合物的晶体结构：研究人员成功解析了 WT 人类 Brachyury - DNA 复合物（分辨率为 2.25 ?）和与脊索瘤相关的 G177D 变异体 Brachyury - DNA 复合物（分辨率为 2.15 ?）的晶体结构。这两种结构与之前的 T-box 家族 DNA 复合物结构相似，都具有修饰的免疫球蛋白样 β - 三明治折叠，通过特定的环和 α - 螺旋与 DNA 结合。与其他转录因子家族不同，Brachyury 的最后一个螺旋插入到 DNA 的小沟中，通过两个保守的芳香族侧链与碱基接触，并且蛋白质与核碱基之间只有两个直接氢键。此外，研究还发现 DNA 存在显著扭曲，包括小沟的加宽和两端的变窄，这种变窄可能与回文序列两端的 A - 序列有关。
2. T-box 结合元件识别的结构基础：通过高分辨率的 DNA 复合物结构，研究人员详细研究了 DNA - 蛋白质界面，包括识别水介导的相互作用。他们发现除了直接接触决定碱基特异性外，还有一些间接机制参与碱基识别。例如，对碱基 4 上胸腺嘧啶的识别可能是通过与碱基 5 上胞嘧啶形成分叉氢键来稳定碱基对的弯曲；对碱基 8 和 9 上胸腺嘧啶甲基的疏水相互作用可能有助于这些位点的特异性识别；而对于碱基 6 和 7 的识别机制则较为复杂，可能与水分子网络有关。
3. WT 和 G177D 结构的比较：WT 和 G177D 变体的结构非常相似（RMSD 为 0.8 ?），但在某些环的构象上存在细微差异。G177D 替换位于 F 和 G 链之间的环上，远离 DNA 界面，该替换导致环的构象发生显著变化，形成了新的盐桥。虽然这种变化在局部可能很显著，但似乎无法通过蛋白质传递到 DNA 结合位点。通过分析亚基之间的界面发现，两者在界面面积和计算的能量贡献上存在微小差异，但这些差异不太可能对 Brachyury 的生物学活性产生影响。
4. G177D 变体对 DNA 结合亲和力的影响：研究人员通过 EMSA 和 SPR 实验测试了 G177D 变体对 DNA 结合亲和力的影响。结果发现，WT 和 G177D 变体对回文重复序列的 DNA 都有较高的结合亲和力，表观解离常数（Kd）约为 1 nM，对单个位点探针或天然启动子序列的结合亲和力较低（Kd 为 30 - 40 nM）。在 EMSA 实验中，没有观察到 WT 和变体蛋白在总体结合亲和力上的显著差异，在 SPR 实验中，WT 和 G177D 变体与回文 DNA 序列结合的表观解离常数分别为 14.8 ± 2.4 nM 和 17.9 ± 2.9 nM，也没有显著差异。此外，研究还发现 Brachyury 与 DNA 的结合存在一定的协同性，可能是由于一个位点结合时小沟的加宽降低了附近第二个原聚体结合时小沟加宽的能量障碍。
5. 脊索瘤相关变体在细胞系中的转录情况：通过 DSF 实验发现，WT 和 G177D Brachyury 的熔解温度（Tm）仅有约 0.7°C 的微小差异，表明蛋白质稳定性差异可能不是 G177D SNP 与脊索瘤关联的原因。对 9 个脊索瘤细胞系进行基因分型发现，大多数细胞系（6/9）为与脊索瘤相关的 SNP 纯合子，并且在杂合细胞系 UM - Chor1 和 CH22 中，WT 和 G177D 等位基因的转录水平大致相等。这表明针对 Brachyury 的治疗可能需要同时靶向 WT 和 G177D 变体。
6. Brachyury 的晶体片段筛选：通过对 Brachyury 结构的可成药性分析发现，其结构中只有三个中等体积的口袋，根据药物 - 相似密度指标预测这些口袋不太可能成药。然而，研究人员对 WT 和 G177D 变体的 Brachyury DNA 结合域进行了晶体片段筛选，分别在 WT 晶体中发现了 24 个片段结合在热点口袋 A，4 个片段结合在口袋 B；在 G177D 晶体中发现了 9 个片段结合在口袋 C，3 个片段结合在与 WT 口袋 A 大致等效的口袋 A’，4 个片段结合在口袋 D。这些口袋与 DNA 结合界面、二聚化界面或下游信号传导可能存在关联，但目前还不清楚哪些口袋在化合物结合后会抑制 Brachyury 或调节其功能。
7. 片段到强效 Brachyury 结合剂的结构引导优化：受到发现的可与 Brachyury 结合的口袋的鼓舞，研究人员启动了药物化学研究，以优化片段衍生分子的效力。他们以在口袋 A’中发现的噻唑片段为基础，通过一系列化学修饰，如改变噻唑环上的取代基、将乙酰胺转化为环丙基乙酰胺、用嘧啶替代噻唑环等，成功提高了化合物的结合亲和力，使部分化合物的表观结合亲和力达到低 μM 范围（14 - 20 μM）。这些化合物虽然目前还不是 Brachyury 功能的抑制剂，但可以作为进一步开发 PROTAC 弹头（proteolysis targeting chimeras，蛋白水解靶向嵌合体，一种能够诱导靶蛋白降解的分子）的起点，用于诱导 Brachyury 的降解。

研究结论与讨论

本研究通过结构引导的方法，对人类 Brachyury 转录因子进行了深入研究。研究人员成功解析了 Brachyury 与 DNA 结合的结构，以及其与脊索瘤相关变体的结构差异，并通过晶体片段筛选发现了多个可与 Brachyury 结合的口袋，进一步通过结构引导的化学优化，得到了具有低 μM 结合亲和力的化合物。虽然这些化合物目前还不是 Brachyury 功能的抑制剂，但它们为后续开发针对 Brachyury 的癌症治疗药物提供了重要的起点。

从研究结果来看，针对 Brachyury 的有效治疗可能需要同时靶向 WT 和 G177D 变体，这为未来的治疗策略提供了方向。同时，研究中发现的结合口袋和优化后的化合物，为进一步研究 Brachyury 的功能以及开发 PROTAC 弹头奠定了基础。这些化合物可以作为化学探针，用于确定 WT 和 G177D 变体在脊索瘤模型中的相对功能作用，从而为最佳治疗策略提供依据。

此外，本研究还展示了结构引导的基于片段的方法在识别难以成药的蛋白质结合剂方面的强大能力。尽管低 μM 结合剂在传统的基于占有率驱动的模型中不足以实现药理学抑制，但在其他蛋白质靶点中，这种中等亲和力的结合剂已被证明可以作为有效的 PROTAC 弹头，通过事件驱动的药理学发挥作用。这表明，新兴技术，如 X 射线晶体学片段筛选，有望将转录因子从难以成药的类别中移除，使转录因子成为有价值且可处理的药物发现靶点。

综上所述，这项研究为癌症治疗领域带来了新的希望，为后续开发针对 Brachyury 的靶向治疗药物提供了重要的理论依据和实践基础，有望推动癌症治疗技术的进一步发展。