质外体 pH—— 揭开下胚轴响应生长素剂量与光照生长调控机制的关键密码

为解决生长素双相效应及光影响其作用机制不明的问题，西南大学研究人员开展下胚轴生长响应研究。结果发现质外体 pH 是关键，光照与生长素拮抗调控其生长。此研究为植物生长调控提供新视角，强烈推荐科研读者阅读。

　　

西南大学（School of Life Sciences, Southwest University）的研究人员在《Nature Plants》期刊上发表了题为 “The apoplastic pH is a key determinant in the hypocotyl growth response to auxin dosage and light” 的论文。这一研究在植物生长调控领域具有重要意义，为深入理解植物如何响应生长素（auxin，一种植物激素，在植物生长发育过程中起着关键作用 ）和光照，以及二者如何协同影响植物生长提供了关键线索，有望为农业生产和植物生物技术的发展提供理论基础。

研究背景

植物的伸长生长受光照和植物激素相互作用的强烈影响。生长素作为调控植物伸长生长的核心植物激素，其作用却充满谜团。一方面，生长素通常促进下胚轴（hypocotyl，种子萌发后连接胚芽和胚根的部分 ）伸长，但过量的生长素反而会抑制伸长。另一方面，光照条件也会改变下胚轴对生长素的响应，在光下生长素往往促进下胚轴伸长，而在黑暗中则抑制伸长，这种现象被称为生长素的双相效应或双重效应。自 1933 年以来，人们就发现了生长素浓度与植物生长的复杂关系，然而，生长素剂量和光照条件究竟如何改变植物对其的响应，这一机制长期以来一直不为人知。

“酸生长理论” 认为，生长素通过激活质膜质子泵 H? -ATPases（AHAs，在拟南芥中存在的一种酶，能将质子泵出细胞 ），使质子外流到细胞外空间，导致质外体酸化，进而激活细胞壁修饰蛋白，使细胞壁松弛并重塑，同时伴随着细胞膨压增加，驱动细胞扩张。SAURs（Small Auxin-Up RNAs，一类受生长素诱导表达的小分子 RNA ）在这一过程中起着关键作用，它能与 PP2C-D 磷酸酶结合并抑制其活性，间接诱导 H? -ATPase 的活性，引起质外体酸化。尽管这一理论得到了越来越多的支持，但高剂量生长素抑制下胚轴伸长的机制，以及光照导致下胚轴对生长素响应发生巨大逆转的原因，仍然是未解之谜。

研究方法

1. 植物材料与生长条件：研究选用哥伦比亚 - 0（Col - 0）生态型的拟南芥植株，对种子进行表面消毒、低温分层处理后，在不同光照条件和含有特定化学物质的培养基上培养，以观察植株的生长表型。
2. 构建质粒与转基因植株：通过基因克隆和载体构建技术，将目标基因如 SAURs 相关基因导入拟南芥，获得过表达和基因编辑突变体植株，用于研究基因功能。
3. RNA 测序与分析：对不同处理条件下的拟南芥下胚轴进行 RNA 提取和测序，分析基因表达谱的变化，探究生长素和光照对基因表达的影响。
4. H? 通量测量：利用非损伤微测技术（NMT）系统，测量下胚轴表皮细胞的 H? 通量，以了解质膜 H? -ATPase 的活性变化。
5. 其他技术：运用时间推移成像和定量测量下胚轴生长、显微镜观察、蛋白质提取和免疫印迹、HPTS 染色等多种技术，从不同角度对下胚轴的生长、细胞内的生理变化进行研究。

研究结果

1. 生长素对下胚轴的影响具有剂量和光照依赖性：研究人员用不同浓度的 NAA（1 - 萘乙酸，一种生长素类似物 ）处理黑暗和光照下生长的拟南芥幼苗，发现黑暗中 NAA 抑制下胚轴伸长，而光照下则促进伸长。用不同浓度的生长素类似物 picloram（Pic）处理幼苗，并改变处理时间，结果表明下胚轴对生长素的响应不仅取决于生长素浓度，还与处理时间有关。通过对去顶幼苗预处理生长素生物合成抑制剂，发现高浓度生长素最初促进黑暗中生长的下胚轴伸长，但数小时后转为抑制，这些实验表明下胚轴对生长素的响应取决于生长素浓度和处理时间的累积效应。
2. 光下和暗下下胚轴转录组对生长素剂量的响应：对不同处理的下胚轴进行转录组分析，发现 5 μM Pic 在光下生长的下胚轴中诱导的响应比在黑暗中生长的下胚轴弱，但总体上生长素诱导的转录组谱在光下和暗下相似。SAUR 基因家族成员在光下和暗下均受 picloram 浓度依赖性诱导表达，Aux/IAA、PP2C - D 和 ACS 基因在光下和暗下也表现出相似的生长素响应表达模式，只是存在定量差异。这说明下胚轴的转录程序随着生长素浓度的增加而逐渐激活，且光下和暗下的模式相似，未发现大规模转录重编程与下胚轴响应的逆转相对应。
3. SAURs 是下胚轴双相响应的关键介质：研究人员检测了组成型表达 SAUR50 或 SAUR66 - GFP 的转基因植株，发现它们表现出组成型生长素表型，即下胚轴伸长且对生长素不敏感。利用 CRISPR/Cas9 系统构建 SAUR 基因的高阶突变体，这些突变体在黑暗中生长时，下胚轴比野生型短，且对 picloram 抑制下胚轴生长的敏感性降低；在光下，野生型幼苗经 Pic 处理后下胚轴伸长，而突变体的刺激响应显著降低，其中 saur19Tredecuple 对生长素表现出强烈的不敏感性，这些结果表明 SAURs 在生长素对下胚轴伸长的双相控制中起着关键作用。
4. 增加 SAUR 水平导致下胚轴双相生长：研究人员获得了多个表达不同水平 SAUR 基因的转基因株系，如 35S:SAUR15 - GFP。在黑暗中，适度过表达 SAUR15 的幼苗下胚轴比野生型长，但当 SAUR15 过表达超过一定倍数（130 倍 ）后，下胚轴逐渐变短；在光下，除个别株系外，SAUR15 过表达株系的下胚轴均比野生型长，且促进作用在 SAUR15 过表达超过一定水平后趋于平稳。在其他 SAUR 基因过表达的转基因株系中也观察到类似现象，这表明 SAURs 对下胚轴伸长的促进作用存在剂量阈值，超过阈值后则会抑制伸长。
5. 质膜 H? -ATPase 激活诱导下胚轴双相伸长：用 Pic 处理黄化下胚轴，发现 pT - AHA（H? -ATPase C 末端倒数第二个苏氨酸的磷酸化形式 ）磷酸化水平随 Pic 浓度增加而增加，且 SAUR15 过表达也会导致 pT - AHA 磷酸化和 H? 通量增加。利用真菌毒素 fusicoccin（FC，一种能使质膜 H? -ATPase 保持活性状态的化学物质 ）处理幼苗，发现低浓度（0.25 μM ）的 FC 促进下胚轴伸长，而高浓度（1 μM 和 5 μM ）则抑制伸长，时间推移成像显示高浓度 FC 最初促进伸长，但数小时后生长速率下降。这说明增加质子泵活性也会导致下胚轴伸长的双相响应，适度的质膜 H? -ATPase 活性促进下胚轴伸长，而过度刺激则会抑制伸长。
6. 生长素剂量增加逐渐酸化下胚轴质外体：利用 pH 敏感染料 HPTS 染色和 apo - pHusion 标记系检测发现，高浓度生长素（如 0.5 μM 和 5 μM IAA、Pic ）处理会导致下胚轴表皮质外体 pH 降低，即使此时下胚轴生长受到抑制。yuc1D 突变体（内源性生长素水平高 ）的下胚轴也表现出较低的质外体 pH 和较高的 H? 通量。SAURs 高表达植株的质外体 pH 也较低，而 SAUR 基因功能缺失突变体则表现出 NAA 诱导的 pT - AHA 磷酸化、H? 外流和质外体酸化受损。这些结果表明，生长素剂量增加会逐渐诱导 SAUR 表达，进而稳定激活质膜 H? -ATPases，降低质外体 pH，但下胚轴的响应呈现双相模式。
7. 低 pH 阈值划分双相生长响应：将 2 天龄的黄化幼苗置于不同 pH 值的液体 MS 培养基中，发现降低培养基 pH 从 9.8 到 5.3 可促进下胚轴生长，最适 pH 约为 5.3，而 pH 低于 4.4 则会抑制下胚轴伸长。SAUR15 过表达株系对酸处理更敏感，在较低 pH 培养基中生长受到抑制。用质膜 H? -ATPase 抑制剂 protostatin - 1（PS - 1）处理幼苗，发现 PS - 1 可缓解高浓度生长素和 SAUR15 过表达导致的下胚轴生长抑制。PP2C - D1（质膜 H? -ATPases 的内源性天然抑制剂 ）过表达也能抑制生长素诱导的下胚轴抑制。此外，提高培养基 pH 可减轻高浓度生长素对下胚轴伸长的抑制作用，这些结果表明质外体过度酸化会阻碍下胚轴伸长。
8. 光照增加下胚轴质外体 pH，拮抗生长素作用：在不同光照条件下用 Pic 处理拟南芥幼苗，发现随着光照强度增加，促进下胚轴伸长的 Pic 最佳浓度逐渐升高，光照使下胚轴对生长素剂量的响应向更高耐受性转变。通过 HPTS 染色检测发现，光下生长的下胚轴质外体 pH 明显高于黑暗中生长的下胚轴，且光下生长的下胚轴中 pT - AHA 磷酸化水平较低，PM H? -ATPase 激活水平也较低。这表明光照可增加下胚轴质外体 pH，抵消生长素诱导的酸化，使质外体保持在促进生长的 pH 范围内，从而解释了为什么相同剂量的生长素在光下促进下胚轴伸长，而在黑暗中抑制伸长。
9. 光照和生长素差异调节 SAURs 影响质外体 pH：重新分析 SAUR 基因在黑暗和光照条件下以及黑暗到光照转变过程中的表达，发现黑暗到光照转变后 6 小时内，下胚轴中所有 SAUR 基因的累积表达水平下降。SAUR19 和 SAUR61 亚家族受生长素刺激，但在光下受抑制。pifq（pif1 pif3 pif4 pif5）突变体（SAUR 转录水平大幅下降 ）和 cop1 - 6 突变体（PIFs 不稳定 ）的下胚轴质外体 pH 比野生型高。这些结果表明，光照通过下调 SAUR - PP2C.D - AHA 途径，增加下胚轴质外体 pH，进而影响下胚轴伸长。

研究结论与讨论

本研究表明，下胚轴对生长素的响应主要取决于细胞壁处的质外体 pH。无论生长素浓度和光照条件如何，生长素都会诱导下胚轴质外体酸化，但细胞对酸度增加的响应是双相的。当质外体 pH 高于某个临界低 pH 阈值时，酸生长机制起作用，下胚轴细胞伸长；当质外体 pH 低于该阈值时，进一步的生长素诱导酸化会阻碍下胚轴伸长。这一发现揭示了生长素双相效应的本质是细胞对生长素驱动的质外体 pH 下降的响应，转折点对应于酸生长机制的低 pH 阈值。

研究还发现，下胚轴对生长素剂量的累积总量做出反应，这与质外体 pH 的变化方式相匹配。但生长素与 FC 对下胚轴的影响存在细微差异，暗示生长素可能除了激活 AHAs 外，还影响其他促进下胚轴生长抑制的过程。此外，研究还揭示了生长素核途径中存在多层负反馈控制机制，以防止系统过度刺激，这有助于解释为什么植物能够精确调控生长素的作用。

光照和生长素在调节下胚轴细胞的质外体 pH 方面存在拮抗作用，光照通过提高质外体 pH 抑制下胚轴伸长，而生长素则降低质外体 pH 促进伸长（在一定范围内 ）。这一模型基于下胚轴伸长的数据，具有器官特异性，不适用于根和叶。在根中，生长素诱导质子内流和质外体碱化，与下胚轴中的作用相反。

总的来说，这项研究为植物生长调控机制提供了新的见解，有助于我们更深入地理解植物如何在不同环境条件下调节自身生长。其研究成果不仅在基础科学领域具有重要意义，也为未来农业生产中优化植物生长、提高作物产量提供了潜在的理论依据和技术支持。