联合免疫 SARS-CoV-2 刺突与 SARS-CoV 核衣壳对 K18-hACE2 小鼠的保护及肺病理影响新探

为解决新冠疫苗因病毒变异有效性降低的问题，美国食品药品监督管理局的研究人员开展 SARS-CoV2 刺突和 SARS-CoV 核衣壳联合免疫研究。结果显示联合免疫可保护小鼠但增加肺病理。该研究为新冠疫苗研发提供关键参考，值得一读。

　　

美国食品药品监督管理局生物制品评估和研究中心病毒产品部门（Division of Viral Products, Center for Biologics Evaluation and Research, Food and Drug Administration）的 Jaekwan Kim、Alla Kachko 等研究人员在《npj Vaccines》期刊上发表了题为 “Combined immunization with SARS-CoV2 spike and SARS-CoV nucleocapsid protects K18-hACE2 mice but increases lung pathology” 的论文。这篇论文在新冠疫苗研究领域意义重大，为未来新冠疫苗的优化和改进提供了关键的理论依据与实验参考。

研究背景

截至 2024 年 12 月，新冠病毒（SARS-CoV-2）已在全球范围内感染超过 7.7 亿人，导致 700 多万人死亡，对全球公共卫生构成了巨大威胁。目前，针对新冠病毒刺突蛋白（Spike，S）的疫苗在预防住院和重症方面取得了显著成效。然而，随着时间的推移，S 蛋白不断发生变异，出现了多种令人担忧的变异毒株，这些变异毒株有可能逃避现有疫苗诱导的免疫反应，使得疫苗的有效性受到挑战。因此，诱导更广泛、更持久的免疫反应对于预防新冠疫情的进一步爆发至关重要。

冠状病毒编码四种主要结构蛋白，分别是 S 蛋白、膜蛋白、包膜蛋白和核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N）。其中，N 蛋白的主要功能是包裹病毒 RNA 基因组，并与膜蛋白相互作用以进行病毒粒子的组装。N 蛋白具有高度免疫原性，且相较于 S 蛋白更为保守，因此成为未来新一代疫苗中极具潜力的额外靶点。不过，此前针对 SARS-CoV 的研究表明，对 N 蛋白诱导免疫反应可能会导致疾病加重。而且，尽管 N 蛋白在冠状病毒分离株之间相对保守，但适应性突变仍有可能出现。在这种情况下，使用与流行病毒不匹配的 N 蛋白进行疫苗接种，可能会导致免疫反应不佳，甚至在接触 SARS-CoV-2 后引发更严重的疾病。基于以上种种问题，研究人员开展了此次研究，旨在探索使用不匹配的 N 蛋白进行免疫接种在 K-18-hACE2 转基因小鼠模型中的保护效果以及是否会导致疾病加重。

研究方法

研究人员选用 6 - 8 周龄的 K18-Tg hACE2（K18-hACE2）小鼠进行动物实验，所有实验操作均严格遵循 FDA 怀特橡树综合动物项目批准的动物实验方案。实验过程中，通过肌肉注射的方式给予小鼠不同的腺病毒重组体，包括表达 SARS-CoV 核衣壳蛋白的 Ad-N1、表达 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白的 Ad-N2 以及表达 SARS-CoV-2 刺突蛋白的 Ad-S。在初次接种后的第 70 天，使用 5×10? PFU 的 SARS-CoV-2（USA/WA1/2020）对小鼠进行鼻内接种，以模拟病毒感染。

研究中构建了多种重组非复制型腺病毒载体，如 Ad-N1、Ad-N2 和 Ad-S，其构建依据 AdEasy XL 腺病毒载体系统的制造商说明进行。采用基于慢病毒的 SARS-CoV-2 S 假型病毒中和试验来检测血清的中和抗体滴度，通过 RNA 提取和 RT-PCR 检测来量化 SARS-CoV-2 亚基因组 RNA 的水平，以此评估病毒在组织中的复制情况。利用苏木精和伊红（H&E）染色以及免疫组化染色对肺组织进行组织病理学评估，分析肺组织的病理变化和免疫细胞浸润情况。此外，还运用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中与 SARS-CoV-2 核衣壳或刺突蛋白结合的抗体，通过脾细胞分离和 IFN-γ ELISpot 试验以及流式细胞术分析 T 细胞和 B 细胞的免疫反应 。

研究结果

1. Ad-N1 和 Ad-N2 在 K18-hACE2 小鼠中诱导 SARS-CoV-2 特异性免疫反应：研究人员按照初次接种和加强接种的方案，在第 0 天和第 28 天对小鼠进行肌肉注射接种。结果显示，接种 Ad-N1 或 Ad-N2 的小鼠均产生了 SARS-CoV-2 N 结合抗体，而接种缺乏转基因的 Ad5 载体（Ad-Null）的小鼠则未检测到高于背景的信号。通过 IFN-γ ELISpot 试验发现，Ad-N1 和 Ad-N2 免疫的小鼠均诱导出了 T 细胞反应，且 Ad-N1 免疫的小鼠 IFN-γ ELISpot 反应显著高于 Ad-N2 免疫的小鼠。此外，使用 N220 右旋体检测发现，Ad-N1 组中 N220 特异性 CD8? T 细胞水平显著高于 Ad-N2 组。
2. Ad-N1 诱导更高的 CD8? T 细胞反应，Ad-N2 诱导更高的 CD4? T 细胞反应：利用流式细胞术分析发现，Ad-N1 和 Ad-N2 免疫的小鼠均检测到了 N 特异性 CD4?和 CD8? T 细胞反应。Ad-N1 免疫的小鼠中，产生 IFN-γ 的 CD8?细胞频率显著高于 Ad-N2 免疫的小鼠，同时产生 IFN-γ 和 TNF-α、Granzyme B 和 Perforin 的 CD8? T 细胞水平也更高。而在 CD4? T 细胞方面，Ad-N2 免疫的小鼠中产生 IFN-γ 的 CD4?细胞频率显著高于 Ad-N1 免疫的小鼠，且所有免疫组中产生 IL-4 的 CD4?细胞水平较低，表明免疫小鼠诱导出了 Th1 型反应。
3. Ad-N1 和 Ad-N2 在 SARS-CoV-2 感染小鼠中提供低水平保护：对感染后的小鼠进行观察，Ad-N1 和 Ad-N2 免疫组的生存情况略优于 Ad-Null 免疫组，但差异不显著。在感染后的第 2 天和第 4 天，Ad-N1 和 Ad-N2 免疫小鼠肺部的病毒亚基因组 RNA（sgRNA）水平显著低于 Ad-Null 免疫小鼠，不过 Ad-N1 免疫小鼠在第 7 天的肺部 sgRNA 水平高于 Ad-N2 免疫小鼠。在脑部和鼻甲中，免疫组与 Ad-Null 组的 sgRNA 水平差异不明显。通过对肺组织的病理分析发现，Ad-N1 和 Ad-N2 免疫组的炎症浸润水平在整个随访期间均显著低于 Ad-Null 组，但 Ad-N1 免疫小鼠的炎症浸润在第 2 - 14 天高于 Ad-N2 免疫小鼠。免疫组中 Ad-N1 和 Ad-N2 免疫小鼠表现出轻度的血管周围炎和支气管炎，而 Ad-Null 小鼠症状更为明显。
4. N 的添加对联合免疫中 S 免疫反应的影响：研究人员进一步评估了 Ad-N1 或 Ad-N2 与 Ad-S 联合免疫后的免疫反应、感染结果和肺部病理。结合试验表明，所有免疫组小鼠均诱导出了针对测试抗原的抗体反应，Ad-N1 + Ad-S 组中 S 和 N 结合抗体水平显著高于 Ad-N2 + Ad-S 组和 Ad-S 免疫组，但中和抗体水平较低。ELISpot 分析显示，所有免疫组在受到 SARS-CoV-2 N 或 S 肽库刺激后均产生了特异性反应，Ad-N1 + Ad-S 免疫小鼠在 N 肽刺激后产生 IFN-γ 的细胞频率更高。流式细胞术分析发现，Ad-N1 + Ad-S 和 Ad-N2 + Ad-S 组中针对 S 的 CD8? T 细胞反应高于 Ad-S 单独免疫组。
5. 联合 Ad-N 和 Ad-S 免疫可使小鼠存活，但与 Ad-S 免疫相比增加了肺部病理：对比单独 Ad-S 免疫和联合 Ad-N 免疫的保护效果，发现所有接受 Ad-S 免疫（单独或联合 Ad-N1 或 Ad-N2）的小鼠均 100% 存活，且肺部、鼻甲和脑部的 sgRNA 滴度低于 Ad-Null 组。然而，Ad-N1 + Ad-S 组的病理评分高于 Ad-N2 + Ad-S 组和 Ad-S 单独免疫组，表现为血管周围炎和支气管炎更为严重，细胞增生和肺炎进展程度也更高，但仍低于 Ad-Null 组。免疫组小鼠肺组织中的 T 细胞和 B 细胞簇数量少于 Ad-Null 组，但 T 细胞总体频率更高，B 细胞总数也略高，同时中性粒细胞浸润水平低于 Ad-Null 组。

研究结论与讨论

在这项研究中，研究人员使用 K18-hACE2 小鼠模型，评估了表达 SARS-CoV 或 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白的腺病毒载体（Ad-N1 或 Ad-N2）单独免疫，以及与表达 SARS-CoV-2 刺突蛋白的腺病毒载体（Ad-S）联合免疫的免疫原性和保护效果。结果显示，免疫小鼠对所有抗原均产生了强烈的体液和细胞免疫反应。单独使用 Ad-N1 和 Ad-N2 免疫可对 SARS-CoV-2 感染提供低水平保护，降低肺部病毒 sgRNA 滴度和病理程度。联合 Ad-N 和 Ad-S 免疫成功诱导了针对两种抗原的免疫反应，尽管联合免疫组的中和抗体水平较低，但所有接受 Ad-S 免疫的小鼠均存活，且肺部病毒滴度更低，病理更轻。不过，Ad-N1 与 Ad-S 联合免疫相较于 Ad-N2 + Ad-S 或 Ad-S 单独免疫，会导致小鼠肺部病理增加。

研究人员推测，Ad-N1 免疫小鼠中更高的 T 细胞反应可能是由于 N1 抗原序列中的氨基酸差异导致其加工处理更好，从而增强了抗原表位向免疫细胞的呈递。此外，Ad-N1 免疫小鼠中更强的 T 细胞免疫反应在感染 SARS-CoV-2 后可能导致 T 细胞过度激活，产生更多的细胞因子和炎症分子，进而增加肺部病理。而 Ad-N2 免疫小鼠中更高的 CD4? T 细胞反应可能使其在感染后具有更好的辅助 T 细胞反应，从而更好地控制病毒复制。

此次研究表明，核衣壳抗原能够诱导强烈的免疫反应，即使是不匹配的抗原也能在 K18-hACE2 小鼠中对 SARS-CoV-2 感染提供一定程度的保护。N 和 S 抗原联合免疫不会损害保护效果，但 N 对抗 S 中和抗体反应可能有轻微负面影响，并且与单独 S 免疫相比，N1 联合免疫会增加小鼠的炎症反应。不过，这些结果是在 K18-hACE2 转基因小鼠模型中得出的，SARS-CoV 的 N 抗原导致的肺部病理增加在人类感染中不一定会出现。尽管如此，S 和 N 联合免疫产生的增强 T 细胞免疫在人类中可能会导致细胞因子产生增加和炎症反应，不过如果这种联合疫苗能在人群中提供更广泛的保护，那么这些结果或许是可以接受的。

这项研究为新冠疫苗的研发提供了重要的参考，让科研人员对核衣壳蛋白作为疫苗靶点有了更深入的认识，有助于在未来开发出更有效、更安全的新冠疫苗，为全球抗击新冠疫情提供有力支持。