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为探究尼古丁成瘾相关因素，内布拉斯加大学林肯分校的研究人员开展 “巴甫洛夫条件反射对尼古丁摄取影响” 的研究。结果显示该影响存在剂量和性别差异。此研究为理解尼古丁成瘾机制、制定防治策略提供关键依据，强烈推荐科研读者阅读。
内布拉斯加大学林肯分校（University of Nebraska-Lincoln）的研究人员 Scott T. Barrett、Kathleen R. McNealy 等人在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Pavlovian conditioning with the internal stimulus effects of intravenous nicotine heightens later nicotine taking with variation by dose and sex” 的论文。这篇论文在尼古丁成瘾研究领域意义重大，为深入理解尼古丁成瘾机制以及制定针对性的干预措施提供了关键依据，有助于推动医学健康领域在烟草使用相关疾病防治方面的发展。
研究背景
烟草使用一直是全球范围内严重的公共卫生问题。长期使用烟草制品会引发诸多健康问题，像肺部疾病、心脏病以及多种癌症。而且，吸烟还常与注意缺陷多动障碍（ADHD）、精神分裂症、酒精使用障碍等疾病并发。即便如今电子烟（vaping）盛行，所谓的电子尼古丁递送装置看似是一种降低危害的方式，但实际上这些大多未经严格监管的含尼古丁产品，其对健康的负面影响正不断被揭示，其中尼古丁依赖就是一大突出问题。
在尼古丁自我给药（self - administration）研究早期，尼古丁能否维持可靠的药物摄入量存在争议。有观点认为，与精神运动兴奋剂和阿片类药物不同，尼古丁自身难以维持稳定的药物摄入水平。不过后来人们逐渐认识到，其他因素会影响尼古丁的消费。Goldberg 等人提出，与吸烟相关的其他刺激可能获得条件强化价值，这一观点认为这些刺激与尼古丁的主要强化效应在时间上紧密相连。但该概念模型存在可完善之处：一方面，人们在消费尼古丁时，往往还有其他强化因素存在，比如社交互动、放松氛围、酒精等，吸烟相关刺激可能因与这些因素配对而获得条件强化价值；另一方面，摄入尼古丁产生的可感知的内部刺激效应也不容忽视，它如同其他内感受和外感受刺激一样，可通过条件作用过程被改变。此前研究已证实，尼古丁刺激能在巴甫洛夫条件反射（Pavlovian conditioning）中获得条件强化价值，进而影响后续的尼古丁自我给药行为。然而，目前对于导致尼古丁摄入量增加的相关因素了解甚少，而且此前研究未充分探究低剂量尼古丁的刺激效应以及性别差异的影响。因此，开展此项研究意义重大。
研究方法
研究人员选用 240 只 Sprague - Dawley 大鼠（120 只雌性，120 只雄性），这些大鼠来自 Envigo，到达实验室时约 9 周龄。实验前，大鼠在温度和湿度可控的环境中适应一周，期间自由进食和饮水，但在条件反射训练前 24 小时开始限制食物摄入，以维持其体重为自由进食时的 90% 。
实验在 20 个标准条件反射箱中进行，箱内配备了多种装置，如用于提供蔗糖溶液的凹槽式饮水器、监测头部进入饮水器的红外光束、控制静脉注射的电脑控制可变速度注射泵等。实验使用的药物是（-）- 尼古丁酒石酸氢盐，溶解在 0.9% 无菌生理盐水中，并调整 pH 值至 7.0 ± 0.2，根据大鼠体重确定尼古丁（0.003、0.01 或 0.03mg/kg/ 次输注）或生理盐水的静脉注射剂量。
实验前，大鼠需接受手术植入颈静脉导管。术后，大鼠在恢复期间每天用含肝素的无菌生理盐水和 Baytril 冲洗导管，以防止血液凝固和细菌感染。在实验开始前和每次实验后，也都要对导管进行冲洗。实验结束前，通过向导管内注入 0.1mL 赛拉嗪（xylazine）检查导管通畅性，若大鼠在 30 秒内出现共济失调症状，则判定导管通畅。
在实验过程中，大鼠需经历多个阶段。首先是饮水器熟悉训练，手术后恢复一天，大鼠会进行为期两天的饮水器熟悉训练，训练时用可变时间（VT）86 秒的强化程序提供 60 次 4 秒的水。之后是内感受条件反射训练，大鼠被随机分为八组，根据分配的尼古丁剂量（0 [生理盐水]、0.003、0.01 或 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁）和条件反射安排（配对或不配对）进行 24 天、每天 2 小时的训练，每次训练包含 10 次条件反射试验。在配对组中，每次输注尼古丁后 30 秒提供 4 秒的 26% 蔗糖溶液；在不配对组中，蔗糖溶液在输注尼古丁后 4 - 8 分钟提供。实验通过计算每次尼古丁输注后 30 秒内头部进入饮水器的次数与输注前 30 秒内次数的差值，作为条件反应的主要测量指标。最后是尼古丁自我给药阶段，在条件反射训练结束后的第二天，实验箱重新配置，安装带有红外监测的鼻触装置。大鼠进行为期 14 天、每天 2 小时的自我给药实验，根据渐进比率（PR）时间表进行反应，一个鼻触孔为活动孔，按下活动孔可获得尼古丁输注，另一个为非活动孔，按下无任何程序设定的结果。实验主要测量指标包括获得的输注次数、主动鼻触次数以及辨别指数（活动孔鼻触次数 /（活动孔鼻触次数 + 非活动孔鼻触次数））。
研究数据采用 R 统计程序进行分析，使用四向混合效应方差分析（ANOVA），性别、尼古丁剂量和条件刺激 - 非条件刺激关系（CS - US Relation）作为组间因素，实验阶段作为组内因素。所有分析的统计学显著性设定为 p < 0.05 ，并使用 Holm - ?idàk 校正进行事后成对比较，以校正多重比较。
研究结果
- 内感受条件反射：四向 ANOVA 分析显示，条件刺激 - 非条件刺激关系、剂量和实验阶段均有显著主效应，且存在多个交互作用。具体来看，在 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁组中，配对的雌性大鼠在多个实验阶段的反应次数多于不配对的雌性大鼠，配对的雄性大鼠在多个阶段的反应次数也多于不配对的雄性大鼠；在 0.01mg/kg/ 次输注尼古丁组中，同样出现配对大鼠反应次数多于不配对大鼠的情况，但在 0.003mg/kg/ 次输注尼古丁组和生理盐水组中，未观察到显著差异。而且，在 0.01mg/kg/ 次输注尼古丁组中，雌性大鼠的条件反应似乎比雄性大鼠出现得更快。此外，在 0.01 和 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁剂量组的部分实验阶段，雌性大鼠的条件反应大于雄性大鼠。在配对组中，0.03mg/kg/ 次输注尼古丁的大鼠在多数实验阶段的条件反应大于 0.01mg/kg/ 次输注尼古丁的大鼠，也大于 0.003mg/kg/ 次输注尼古丁和生理盐水组的大鼠；0.01mg/kg/ 次输注尼古丁的大鼠在多个阶段的条件反应大于 0.003mg/kg/ 次输注尼古丁和生理盐水组的大鼠。
- 自我给药 - 输注次数：四向 ANOVA 分析表明，性别、条件刺激 - 非条件刺激关系、实验阶段和剂量均有显著主效应，且存在多个交互作用。配对大鼠在所有 14 个实验阶段获得的输注次数均多于不配对大鼠。在尼古丁剂量与实验阶段的交互作用方面，0.03mg/kg/ 次输注尼古丁的大鼠在多个阶段获得的输注次数多于 0.01mg/kg/ 次输注尼古丁的大鼠，也多于 0.003mg/kg/ 次输注尼古丁和生理盐水组的大鼠。在性别、剂量和条件刺激 - 非条件刺激关系的三向交互作用分析中，未配对的雌性大鼠对任何尼古丁剂量的自我给药均未显著高于生理盐水；配对的雌性大鼠在 0.01 和 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁组获得的输注次数多于生理盐水组和 0.003mg/kg/ 次输注尼古丁组。未配对的雄性大鼠在 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁组获得的输注次数多于其他组；配对的雄性大鼠在 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁组获得的输注次数也多于其他组。此外，配对的雌性大鼠在 0.01mg/kg/ 次输注尼古丁组获得的输注次数多于配对的雄性大鼠。
- 自我给药 - 主动鼻触次数：四向 ANOVA 分析显示，性别、条件刺激 - 非条件刺激关系、实验阶段和剂量均有显著主效应，且存在多个交互作用。在 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁剂量组，配对大鼠在多个实验阶段的主动鼻触次数多于不配对大鼠；在 0.01mg/kg/ 次输注尼古丁组，配对大鼠在所有 14 个实验阶段的主动鼻触次数均多于不配对大鼠，但在 0.003mg/kg/ 次输注尼古丁组和生理盐水组中，未观察到显著差异。在配对组中，0.03mg/kg/ 次输注尼古丁的大鼠在多个阶段的主动鼻触次数多于其他组；0.01mg/kg/ 次输注尼古丁的大鼠在多个阶段的主动鼻触次数多于生理盐水组和 0.003mg/kg/ 次输注尼古丁组。未配对的 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁的大鼠在部分阶段的主动鼻触次数多于其他组，但未配对的 0.01mg/kg/ 次输注尼古丁的大鼠在任何阶段的主动鼻触次数均未多于生理盐水组和 0.003mg/kg/ 次输注尼古丁组。在性别、剂量和条件刺激 - 非条件刺激关系的三向交互作用分析中，未配对的雌性大鼠对任何尼古丁剂量的反应均无显著影响；配对的雌性大鼠在 0.03 和 0.01mg/kg/ 次输注尼古丁组的主动鼻触次数多于不配对的雌性大鼠。雄性大鼠在两种条件刺激 - 非条件刺激关系下，0.03mg/kg/ 次输注尼古丁维持的主动鼻触次数大于其他组，但 0.01 和 0.003mg/kg/ 次输注尼古丁在配对或未配对雄性大鼠中均未维持比生理盐水组更高的主动鼻触次数。此外，配对的 0.01mg/kg/ 次输注尼古丁组中，雌性大鼠的主动鼻触次数多于雄性大鼠。
- 自我给药 - 辨别指数：四向 ANOVA 分析表明，条件刺激 - 非条件刺激关系、尼古丁剂量和实验阶段有显著主效应，且存在条件刺激 - 非条件刺激关系与尼古丁剂量的交互作用。在性别、剂量和条件刺激 - 非条件刺激关系的三向交互作用分析中，配对的雌性大鼠在 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁组的辨别指数优于生理盐水组和 0.003mg/kg/ 次输注尼古丁组；配对的雌性大鼠在 0.01 和 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁组的辨别指数优于不配对的雌性大鼠。在所有组中，只有配对的雄性和雌性 0.01 和 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁组以及未配对的雄性 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁组的辨别指数优于随机水平（0.5），但除了配对和未配对的雄性 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁大鼠以及配对的雌性 0.01 和 0.03mg/kg/ 次输注尼古丁组外，其他组的辨别指数均显著低于稳健反应辨别标准（0.8）。
研究结论与讨论
该研究成功复制了先前的发现，即静脉注射尼古丁能在大鼠体内产生内感受刺激效应，这种效应可与奖赏性强化形成关联，进而显著提高后续的尼古丁自我给药行为。而且，研究进一步拓展了这一成果，揭示了这种效应存在剂量依赖性，并且在不同性别间存在差异。
具体而言，0.01 和 0.03mg/kg 的静脉注射尼古丁能够产生足够的刺激效应，与蔗糖递送形成条件关联，从而增加雌性大鼠在这些剂量下的尼古丁自我给药行为。在雄性大鼠中，虽然也能观察到尼古丁 - 蔗糖条件关联的形成，但这对它们后续的尼古丁自我给药行为并无明显影响，0.03mg/kg 的尼古丁输注对雄性大鼠具有强化作用，且这种强化作用与尼古丁 - 蔗糖条件关联无关。相反，没有尼古丁 - 蔗糖配对历史的雌性大鼠，对任何剂量的尼古丁都没有明显的强化反应；0.01mg/kg 的尼古丁输注对没有配对学习历史的雄性和雌性大鼠均无强化作用，但对有尼古丁 - 蔗糖配对历史的雌性大鼠具有强化作用。这表明，尼古丁的主要强化效应可能是雄性大鼠自我给药的更重要动机因素，而与尼古丁刺激效应的条件关联对雌性大鼠的自我给药行为影响更大。
这些发现对于理解男性和女性在吸烟和尼古丁使用方面的动机差异具有重要意义。男女在尼古丁依赖的患病率和本质上存在显著差异，女性吸烟频率更高，戒烟尝试更少，戒烟后更容易复发，而且尼古丁替代疗法对女性吸烟者的效果较差，吸烟的感官和社会背景对女性的影响更大。此前研究还发现，女性对尼古丁的主要强化效应可能不如男性敏感，但对吸烟的感官元素更敏感。本研究进一步证实，在尼古丁自我给药和吸烟方面，雄性和雌性存在动机差异，填补了相关领域的重要空白。
不过，该研究也存在一定局限性。研究没有设置能明确评估尼古丁单独主要强化效应的对照条件，虽然可以根据现有实验结果推断某些剂量下尼古丁的强化效应，但无法精确确定其单独作用。此外，本研究结果与之前研究存在差异，主要体现在之前研究中未配对组的雄性大鼠在 0.03mg/kg 尼古丁输注剂量下未表现出可靠的自我给药行为，而本研究中出现了显著的自我给药行为。但考虑到之前研究在分析性别效应时统计效力不足，这种差异需要谨慎看待。通过将本研究与之前研究的数据合并分析，发现 0.03mg/kg 尼古丁输注的主要强化效应可能存在性别差异，但这种差异较小，仅表明雄性大鼠存在相对较弱的强化效应。
总体而言，本研究表明涉及尼古丁内感受刺激效应的奖赏性学习历史，能够显著改变尼古丁在后续自我给药中的强化效应，且这种效应具有剂量依赖性并与性别相关。这丰富了人们对尼古丁强化心理过程的理解，缩小了尼古丁较弱的主要强化效应与强大成瘾潜力之间的认知差距。研究结果还提示政策制定者，在制定尼古丁产品监管政策时，应考虑更低的剂量阈值，以预防尼古丁成瘾。同时，研究也警示人们要关注尼古丁产品添加剂可能带来的风险，这些添加剂可能与尼古丁的刺激效应形成兴奋性关联，从而增加尼古丁的强化能力和成瘾潜力。未来，研究人员、临床医生和政策制定者都应更加重视巴甫洛夫条件反射在改变尼古丁强化效应以及决定其滥用和成瘾潜力方面的作用。
