肺炎克雷伯菌致病机制新发现：荚膜多糖的关键作用

本文揭示肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）荚膜多糖（CPS）在致病中的作用，为防治感染提供新策略。

　　### 肺炎克雷伯菌致病机制新发现：荚膜多糖的关键作用
肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种重要的临床病原菌，可引发多种感染，尤其是在免疫系统受损的患者中。其高毒力菌株（hvKp）还能感染健康人群，引发严重疾病。在肺炎克雷伯菌的众多毒力因子中，荚膜多糖（Capsule polysaccharide，CPS）被认为是最重要的一种，但它增强细菌生存适应性的机制尚不清楚。

肺炎克雷伯菌及其毒力因子概述

肺炎克雷伯菌是一种人类共生菌和机会致病菌，可导致败血症、肺炎、尿路感染和软组织感染等多种医疗相关感染。与经典肺炎克雷伯菌（cKp）不同，高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）通常感染社区中的健康个体。hvKp的毒力与多种质粒编码的毒力因子有关，如iuc、peg - 344、rmpA和rmpA2等。其中，iuc编码的气杆菌素对 hvKp在人体腹水或血清中的生长和存活至关重要，而 PEG344 则有助于细菌的生存和竞争，在肺部感染模型中对细菌的完全毒力是必需的。

在已知的毒力因子中，CPS 起着多方面的作用。它能保护细菌免受巨噬细胞、中性粒细胞、上皮细胞和树突状细胞的调理吞噬作用，还能赋予细菌对抗菌肽的抗性。此外，CPS 还可抑制宿主的早期炎症反应，通过抑制 TLR2 和 TLR4 信号通路以及 NOD1 依赖的途径减少 IL - 8 的表达，同时损害树突状细胞的成熟，降低 IL - 12 和 TNF - α 等细胞因子的产生，从而帮助细菌逃避宿主防御并在体内繁殖。然而，不同研究中 CPS 对宿主免疫功能的影响存在矛盾，这可能与体内外实验条件的差异有关。

CPS 对肺炎克雷伯菌毒力的影响

为了探究 CPS 对不同血清型肺炎克雷伯菌毒力的贡献，研究人员选取了临床分离株，利用小鼠败血症模型测试其毒力水平。实验中去除了测试菌株携带的所有毒力质粒，以排除质粒上毒力因子或调控基因对菌株毒力的影响。研究结果显示，代表五种不同荚膜类型和血清型的菌株表现出显著不同的毒力水平。例如，感染 K1 和 K2 菌株的小鼠死亡率较高，而感染 K36 和 K64 菌株的小鼠死亡率相对较低。进一步通过尿糖醛酸定量评估菌株的 CPS 产量，发现 CPS 产量与肺炎克雷伯菌的毒力潜力并无相关性。如毒力水平最高的 K1 菌株，其 CPS 产量仅处于中等水平。

为了测试 CPS 对不同菌株毒力差异的贡献程度，研究人员利用双质粒 CRISPR 系统 pCasKP - pSGKP 构建了不能产生 CPS 的同基因突变体。实验结果表明，这些突变体在感染小鼠时，与亲本菌株相比，毒力明显降低。当用 1×10⁸ CFU 的无荚膜突变体感染小鼠时，不同荚膜类型的突变体感染小鼠的存活率没有显著差异，均约为 20%。这表明肺炎克雷伯菌的毒力潜力主要由荚膜类型决定，而不是 CPS 的产量。同时，无法产生 CPS 会使不同荚膜类型的肺炎克雷伯菌毒力水平降低到几乎无毒的相同水平，这一结果不受细菌遗传背景和其他染色体毒力因子携带情况的影响。

CPS 在肺炎克雷伯菌感染中的免疫作用

为了进一步研究 CPS 在肺炎克雷伯菌感染中的作用，研究人员用能快速引发败血症的 K1 分离株 KP1088PC 感染小鼠。通过流式细胞术检测感染小鼠肺部免疫细胞的数量和类型变化，以监测宿主的免疫反应。结果发现，与假感染组相比，KP1088PC 感染导致小鼠肺部中性粒细胞（CD11b⁺Ly6G⁺）和巨噬细胞（CD11b⁺F4/80⁺）的浸润显著增加。而 CPS 缺陷型菌株感染小鼠时，这些免疫细胞的浸润水平明显低于亲本菌株，这表明 CPS 缺陷型菌株引发的宿主炎症反应减弱。研究人员推测，这可能是由于 CPS 缺失导致细菌在宿主体内的生存能力受损。

此外，感染 KP1088PC 的小鼠肺部巨噬细胞上 CD86 的表达水平较高，表明肺炎克雷伯菌感染促使巨噬细胞向 M1 亚型分化，但这种现象在无荚膜突变体感染的小鼠中未观察到。同时，感染 KP1088PC 还导致败血症小鼠出现淋巴细胞减少，表现为 T 细胞和 B 细胞缺乏，而无荚膜菌株感染的小鼠则未出现这种变化。这些结果表明，CPS 在肺炎克雷伯菌引发的免疫反应中起着重要作用。

为了确定 CPS 对细菌在宿主体内生存的影响，研究人员通过平板计数测定了感染小鼠器官（包括肝脏、脾脏、肾脏和肺）中的活菌数量。结果显示，无荚膜菌株感染小鼠的器官中活菌数量明显低于野生型菌株感染的小鼠，这表明 CPS 能保护肺炎克雷伯菌免受宿主免疫反应的清除，使其在宿主体内更好地生存。对感染小鼠血清代谢物谱的分析表明，野生型肺炎克雷伯菌感染引发了小鼠的细胞因子风暴，大量释放 IFN - γ、TNF - α、IL - 1β、IL - 10、IL - 6 和 CXCL1 等细胞因子和趋化因子。而 CPS 合成缺失的肺炎克雷伯菌在感染小鼠时，诱导这些细胞因子和趋化因子释放的能力明显减弱。

然而，当用高剂量的无荚膜菌株感染小鼠时，小鼠器官中的细菌负荷达到了与野生型菌株感染时相同的水平，同时血清中细胞因子和趋化因子的水平也与野生型菌株感染时相当。这表明缺乏 CPS 的肺炎克雷伯菌在接种细菌数量足够使其在宿主体内生存和传播时，仍然能够诱导强烈的细胞因子释放。因此，CPS 并非激活炎症反应的唯一细胞决定因素，它对肺炎克雷伯菌的作用主要是有助于细菌在宿主体内的长期生存，从而引发更强的免疫反应。

CPS 对肺炎克雷伯菌吞噬作用和细胞内存活的影响

为了研究 CPS 在肺炎克雷伯菌致病过程中的作用是否与其在宿主体内的生存能力有关，研究人员采用巨噬细胞感染模型，在体外研究巨噬细胞与细菌细胞之间的相互作用。在实验中，THP - 1 细胞以感染复数（MOI）为 25 与肺炎克雷伯菌接触。结果发现，与亲本菌株相比，无荚膜菌株感染时被吞噬的细菌百分比显著增加，而用编码 WcaJ 的质粒进行互补则可恢复肺炎克雷伯菌逃避吞噬的能力。共聚焦显微镜研究通过使用表达gfp的菌株 KP1088PC - gfp和 ΔwcaJ - gfp，进一步证实了这一发现。值得注意的是，补充纯化的 CPS 并不能帮助无荚膜突变体菌株逃避吞噬，这表明游离的 CPS 无法保护肺炎克雷伯菌不被内化。

研究人员还监测了这些细胞内菌株的命运。为了进行比较，他们调整了 MOI，以使感染开始时细胞内细菌数量可比。结果发现，两种菌株的存活率没有显著差异。即使无荚膜突变体被内化的细菌数量比亲本菌株多 10 倍，其在巨噬细胞内存活的细菌百分比也没有变化。这些结果表明，肺炎克雷伯菌的 CPS 不影响巨噬细胞的杀菌潜力，尽管它对细菌逃避吞噬的能力有影响。在体内感染的情况下，有荚膜的菌株更能抵抗吞噬作用，并且与 CPS 突变体菌株具有相同的生存能力，野生型菌株倾向于抵抗清除并在细胞外积累。因此，延长生存时间和刺激免疫系统可能是有荚膜细菌引发更强免疫反应的原因之一。

清道夫受体 LOX - 1 在肺炎克雷伯菌吞噬作用中的作用

CPS 如何阻止肺炎克雷伯菌被吞噬是一个有待解答的问题。研究人员对感染 KP1088PC 或不能产生 CPS 的突变菌株的 mTHP - 1 细胞进行了 RNA 测序，发现共有 345 个基因在 KP1088PC 处理和突变菌株处理的巨噬细胞中表达差异显著，其中 6 个基因参与吞噬过程。这些基因中包括编码凝集素样氧化低密度脂蛋白（LDL）受体 - 1（LOX - 1）的OLR1基因，LOX - 1 是一种清道夫受体。

通过实时定量 PCR（qRT - PCR）研究发现，野生型肺炎克雷伯菌刺激后，LOX - 1 的表达水平显著高于假对照。值得注意的是，感染无荚膜突变体菌株的巨噬细胞中 LOX - 1 的 mRNA 水平甚至高于亲本菌株感染的巨噬细胞，这表明肺炎克雷伯菌的 CPS 影响巨噬细胞上 LOX - 1 的表达。这一结果与之前的报道一致，即大肠杆菌可诱导小鼠腹腔巨噬细胞中 LOX - 1 的表达。

由于清道夫受体 LOX - 1 能结合氧化（Ox - ）和乙酰化（Ac - ）LDL 等配体，研究人员用 Ox - LDL 孵育 mTHP - 1 细胞，并测试其对肺炎克雷伯菌内化的影响。结果显示，Ox - LDL 显著抑制了巨噬细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬作用。对野生型肺炎克雷伯菌内化的抑制作用中等但具有统计学意义，而对 CPS 突变体感染的抑制率超过 60%。之前的研究表明，LOX - 1 可识别并结合大肠杆菌表面的 GroEL 蛋白以及肺炎克雷伯菌的外膜蛋白 OmpA，从而增强巨噬细胞对革兰氏阴性菌的粘附并促进病原体的吞噬作用。因此，研究人员推测清道夫受体 LOX - 1 可能通过识别 GroEL 和 OmpA 介导巨噬细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬作用，而 CPS 通过在细菌最外层提供保护涂层，阻止 LOX - 1 对肺炎克雷伯菌的识别，使细菌能够逃避巨噬细胞的吞噬。

CPS 与肺炎克雷伯菌诱导的 M1 极化的关系

之前的研究报道，hvKp感染可诱导间质巨噬细胞（IMs）的募集，这些细胞表达较高水平的 CD80，表明 hvKp感染可在体内诱导 M1 极化。在本研究中，研究人员观察到这种现象仅在野生型菌株感染时出现，而在同基因 CPS 突变体感染时未出现。为了进一步研究肺炎克雷伯菌 CPS 在 M1 极化过程中的作用，研究人员分析了用 K1 - Kp或无荚膜突变体菌株刺激的单核细胞来源巨噬细胞的转录组。结果发现，与假感染组相比，野生型和突变体感染的巨噬细胞中促炎 M1 极化标记物如Il23a、Socs3、Il1b和Il1a的表达水平均较高，这表明 CPS 缺陷型Kp能够驱动 M1 极化。

令人惊讶的是，突变体感染组中编码促炎细胞因子 IL - 1β 和 TNF - α 的基因转录表达水平以及 M1 标记物 CD80 的表达水平均显著高于野生型感染组。通过荧光激活细胞分选（FACS）分析对 RAW264.7 巨噬细胞进行检测，结果显示，无论是否产生 CPS，Kp菌株都能够诱导巨噬细胞向 M1 极化，且感染 CPS 突变体菌株的巨噬细胞上 CD86 的平均荧光强度更高。这些观察结果表明，Kp以 CPS 非依赖的方式诱导 M1 极化。无荚膜Kp菌株不仅保留了免疫原性，还因其高吞噬率引发了更高水平的 M1 极化。在体内模型中，CPS 敲除菌株未能诱导 M1 极化和细胞因子风暴，这可能归因于其在宿主体内生存能力的受损。由于在 CPS 缺陷型菌株感染时观察到更高频率的 M1 巨噬细胞，研究人员推测内化的细菌可能促使巨噬细胞向 M1 亚型分化。这些结果表明，Kp可以调节 CPS 的产生水平来操纵巨噬细胞的极化状态。

研究总结与展望

本研究对肺炎克雷伯菌毒力因子 CPS 在致病过程中的作用进行了全面研究。研究结果表明，荚膜类型是肺炎克雷伯菌菌株毒力水平的主要染色体决定因素，当 CPS 产生停止时，肺炎克雷伯菌建立全身感染和诱导免疫反应的能力会受损。CPS 帮助肺炎克雷伯菌逃避吞噬作用，有助于其在宿主体内获得更高的生存适应性，并有可能诱导更强的细胞因子风暴，这解释了体内外研究结果的差异。

然而，仍有一些问题需要进一步研究。例如，不同 K 类型定义细菌毒力水平的潜在机制，以及 CPS 在宿主 - 病原体相互作用中作为保护外壳的具体作用方式等。此外，本研究主要从宿主角度进行研究，未来的研究可以致力于探究病原体如何应对免疫清除，如对细胞内细菌或宿主器官内细菌进行转录组和蛋白质组分析等。这些研究将有助于更深入地了解肺炎克雷伯菌的致病机制，为开发新的治疗策略以对抗肺炎克雷伯菌感染提供理论依据，有望改善患者的治疗效果和公共卫生状况。