慢性糖皮质激素暴露对人类神经发育中抑制性神经元命运的影响：揭示神经精神疾病潜在机制

本文利用人类神经类器官，研究慢性糖皮质激素（GC）暴露对神经发育的影响。发现 GC 暴露会引起基因表达变化，促进抑制性神经元谱系定向分化，影响神经发育相关基因和转录因子，为理解遗传与环境因素对神经精神疾病的作用提供新视角。

　　### 慢性糖皮质激素暴露对人类神经发育中抑制性神经元命运的影响：揭示神经精神疾病潜在机制
人类大脑发育过程受到严格调控，一旦出现偏差，就可能引发一系列神经发育和精神疾病，如自闭症谱系障碍（ASD）和精神分裂症等。这些疾病既受遗传因素影响，也与环境因素密切相关，其中孕期暴露于糖皮质激素（GC）是一个重要的环境风险因素。在这篇研究中，科研人员深入探究了 GC 暴露对人类神经发育的影响机制。

研究背景

人类神经发育起始于胚胎发生早期，细胞增殖、迁移、分化和突触形成等过程精确有序地进行，这些过程对于构建正常的神经回路至关重要。许多研究表明，携带与神经发育和精神疾病相关遗传变异的基因，在神经发育的关键分子和细胞通路中高度富集。虽然这些疾病具有较强的遗传成分，但环境因素同样不可忽视。孕期暴露于 GC，无论是内源性 GC 水平异常，还是因治疗需要使用合成 GC（如倍他米松、地塞米松），都可能影响胎儿神经发育，进而增加儿童患精神和行为问题的风险。然而，目前关于 GC 影响神经发育的分子和细胞机制仍不明确。

实验设计

研究人员使用两种人类诱导多能干细胞（hiPSC）系（Line 409b2 和 Line FOK4）构建了未引导的神经类器官模型，模拟早期大脑发育过程。他们设计了六种实验条件，包括慢性 GC 暴露（Chr，从第 60 天开始连续暴露 10 天）、对照组（Veh，仅用溶剂处理），以及在第 90 天收集样本时，分别设置了经过 20 天洗脱期后的慢性暴露组（Chr-Veh）、对照组（Veh-Veh），还有在洗脱期后进行 12 小时急性 GC 暴露的实验组（Chr-Acu 和 Veh-Acu）。每种条件设置四个生物学重复，通过这些实验条件来全面评估 GC 暴露对神经类器官的影响。

实验结果

1. 细胞代谢压力评估：研究人员对实验中各类细胞进行了详细分析，通过识别细胞类型标记基因，成功鉴定出 8 种主要细胞类型。他们发现一个无法明确归类的细胞簇，经分析这些细胞大多处于代谢应激状态，属于非存活细胞。剔除这些非存活细胞后，研究发现慢性 GC 暴露样本与对照组样本的细胞活力得分并无显著差异，这表明慢性 GC 暴露不会诱导细胞产生显著的代谢压力，为后续研究排除了细胞活力差异对实验结果的干扰。
2. 转录组响应分析：通过对不同处理条件下的神经类器官进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），研究人员鉴定出 803 个在六种细胞类型（放射状胶质细胞（RG）、增殖神经祖细胞（Cycling）、抑制性神经元（Inh. Neurons）、兴奋性神经元（Ex. Neurons）、未成熟脉络丛细胞（Imm. ChP）和成熟脉络丛细胞（ChP））中差异表达（DE）的基因。这些差异表达基因涉及多个神经发育相关过程，如 “轴突发生”“神经系统发育的负调控” 等，还包括 72 个来自 SFARI 基因数据库的 ASD 风险基因。此外，研究发现慢性 GC 暴露后的转录组变化部分在洗脱期后仍然持续，且超过一半的持续转录变化与 90 天急性 GC 暴露的转录响应重叠，这表明慢性 GC 暴露对细胞的影响具有持续性，且与 GC 的活性密切相关。
3. 神经元谱系定向分化研究：研究人员定义了兴奋性神经元、抑制性神经元和脉络丛细胞三个谱系终点，通过计算细胞沿着伪时间轨迹向各谱系终点分化的概率，探究 GC 暴露对神经命运决定的影响。结果发现，GC 暴露后，细胞向抑制性神经元谱系分化的概率显著增加，且与兴奋性神经元谱系相比，GC 暴露引起的差异表达效应与抑制性神经元谱系驱动基因的相关性更强。这表明 GC 暴露会促进神经类器官向抑制性神经元谱系定向分化。
4. 抑制性神经元数量变化检测：为了进一步验证上述发现，研究人员检测了抑制性神经元特异性标记基因 GAD1 的表达情况。结果显示，在慢性 GC 暴露后，无论是在未引导的神经类器官还是在区域化的腹侧化神经类器官中，GAD1 阳性细胞的比例均显著增加，抑制性神经元与兴奋性神经元的比例也明显上升。即使在 20 天的洗脱期后，90 天龄的 GC 暴露类器官中 GAD1 阳性细胞数量仍保持增加趋势，这进一步证实了 GC 暴露会导致抑制性神经元数量增加。
5. 关键转录因子的作用探究：研究人员通过分析，确定了 15 个可能参与抑制性神经元谱系启动的转录因子（TF），其中 PBX3 在所有数据集中均是抑制性神经元谱系的强驱动基因，且在 GC 暴露后表达上调。实验表明，PBX3 在抑制性神经元中表达最高，其表达水平随伪时间增加而上升。免疫荧光实验也证实，GC 暴露后，PBX3 阳性细胞和 PBX3⁺GAD1⁺双阳性细胞数量显著增加，这表明 PBX3 在 GC 诱导的抑制性神经元谱系启动中发挥着重要作用。
6. 基因调控网络分析：为深入了解基因调控机制，研究人员对 90 天龄的 Line 409b2 神经类器官进行了单细胞染色质可及性测序（scATAC-seq），并将其与 scRNA-seq 数据整合构建基因调控网络（GRN）。结果发现，以 PBX3 为中心的 GRN 中，许多基因对 GC 暴露有响应，且与抑制性神经元谱系相关。在 GC 暴露的类器官中，PBX3 的直接下游靶点中抑制性神经元驱动基因的比例显著增加。通过计算机模拟实验，研究人员发现过表达 PBX3 会促进抑制性神经元分化，而敲除 PBX3 则会逆转这一效应，进一步证明了 PBX3 在抑制性神经元谱系启动中的关键作用。

研究讨论

本研究表明，慢性 GC 暴露会导致神经类器官中细胞类型特异性的基因表达变化，这些变化在多个关键分子和细胞通路中持续存在，且与 GR 激活密切相关。GC 暴露促进了抑制性神经元谱系的定向分化，导致抑制性神经元数量增加，PBX3 在这一过程中发挥了重要作用。此外，研究还发现遗传和环境风险因素在神经发育过程中存在汇聚现象，共同影响神经元谱系决定和细胞命运。

然而，本研究也存在一些局限性。例如，实验主要使用了女性来源的 hiPSC 系，无法揭示 GC 暴露对神经谱系启动的性别差异；使用的未引导类器官分化方案导致类器官主要模拟非端脑区域的神经元，无法全面反映 GC 暴露对端脑神经元谱系启动的影响；在差异表达分析中，为确保结果稳健性，未纳入在两个 hiPSC 系中无一致显著性和效应方向的基因，可能遗漏了一些 GC 调控的转录本。

未来研究可以从多个方向展开。例如，使用更多不同性别的 hiPSC 系进行研究，探究 GC 暴露的性别差异；利用先进的类器官技术，如类器官组装体，构建能够模拟端脑神经元谱系的模型，深入研究 GC 暴露对端脑神经元谱系启动的影响；进一步研究 GC 暴露在不同发育时间点的作用，明确选择性谱系启动与神经元亚型分化时间的关系；探索 PBX3 等转录因子的下游靶点和相互作用伙伴，深入了解抑制性神经元谱系启动的分子机制；利用体外模型系统研究环境暴露导致谱系分化异常后的潜在挽救机制，为深入理解正常大脑发育和神经精神疾病的发病机制提供更多线索。