HIV-1 如何 “智斗” 免疫系统：HLA-II 相关免疫压力下的病毒适应机制与疫苗研发新启示

本文聚焦 HIV-1（人类免疫缺陷病毒 1 型）研究。通过分析两个队列，发现 149 个 HIV-1 clade B 基因组位点受 HLA-II（人类白细胞抗原 II 类分子）相关选择压力影响。研究揭示其适应机制多样，且影响疾病进展，为 HIV-1 疫苗设计提供关键依据。

　　

HIV-1 适应 HLA-II 相关选择压力的研究背景

HIV-1 作为艾滋病的病原体，给全球健康带来沉重负担。尽管抗逆转录病毒疗法（ART）取得了一定成效，但研发有效的 HIV-1 疫苗仍是全球卫生的重点任务。HIV-1 具有高遗传多样性、能建立潜伏病毒库以及善于逃避宿主免疫系统等特点，这使得疫苗研发困难重重。其中，HIV-1 的免疫逃逸能力尤为突出，它通过突变逃避宿主免疫反应，导致病毒持续变异和潜伏感染。

在免疫逃逸方面，HIV-1 对 CD8⁺T 细胞介导的免疫压力的逃逸机制已得到广泛研究。CD8⁺T 细胞通过识别由人类白细胞抗原 I 类分子（HLA-I）呈递在细胞表面的病毒肽来清除被 HIV-1 感染的细胞。因此，HIV-1 逃避 CD8⁺T 细胞免疫的机制可表现为 HLA-I 相关的氨基酸多态性，即病毒适应。这些适应机制主要分为两类：一类是与肽识别丧失相关的病毒多态性，导致免疫逃逸；另一类是与持续肽识别相关的多态性，这种情况会使免疫优势模式向无效的肽特异性 T 细胞反应转变，同时还会改变肽特异性 HLA-I 限制性 CD8⁺T 细胞的转录组，使其向功能障碍表型发展。

相比之下，关于 HIV-1 逃避 HLA-II 限制性 T 细胞免疫的研究较少。虽然已有研究表明 CD4⁺T 细胞能对 HIV-1 施加选择压力，且发现了一些 HLA-II 相关的 HIV-1 适应性突变，但这些适应的潜在机制以及它们与 HLA-I 相关适应机制的异同仍不明确。此外，以往研究未评估 HLA-II 相关免疫压力的其他可能驱动因素，如 HLA-II 限制性 CD8⁺T 细胞的作用。本研究旨在全面剖析 HIV-1 clade B 基因组中 HLA-II 相关的适应情况，为深入理解 HIV-1 免疫逃逸机制和疫苗研发提供依据。

HIV-1 适应 HLA-II 相关选择压力的研究结果

1. 识别 HIV-1 的 HLA-II 相关适应位点：研究人员利用来自美国艾滋病临床试验组（ACTG）和西澳大利亚（WA）HIV 队列研究的近全长 HIV-1 基因组序列和 HLA-DRB1 等位基因数据，确定了 clade B 中与 HLA-II 相关的 HIV-1 适应位点。共检测到 170 个适应位点，涵盖 clade B 基因组中的 149 个位点，这些位点被预测位于体内 HLA-II 限制性 T 细胞靶点内或附近，代表了对 HLA-II 限制性 CD8⁺和 / 或 CD4⁺T 细胞介导的免疫压力的逃避。同时，研究还发现一些位点在 clade B 和 clade C 中均表现出 HLA-II 相关免疫压力，且调节和辅助蛋白往往含有较高比例的 HLA-II 相关 HIV-1 适应位点，这表明 HLA-II 限制性 CD8⁺和 / 或 CD4⁺T 细胞介导的选择压力在整个 HIV-1 蛋白质组中都存在。
2. 预测 HLA-II 限制性 HIV-1 表位引发的 T 细胞反应：为了确定所识别的适应位点的免疫原性，研究人员合成了一组代表假定的 HLA-II 限制性 T 细胞表位的肽。通过对 17 名 HLA-DRB103⁺和 / 或 HLA-DRB107⁺的慢性未经治疗的 HIV-1 clade B 感染受试者进行筛选，发现 60% 的非适应或适应测试肽库能引发阳性的 IFN-γ CD4⁺T 细胞反应，40% 的肽库能引发阳性的 IFN-γ CD8⁺T 细胞反应。与 CD4⁺T 细胞反应相比，CD8⁺T 细胞反应频率较低。此外，研究人员还发现，IFN-γ 对适应的 HLA-II 限制性表位肽的反应多样，其变化幅度可能反映了 HIV-1 对 HLA-II 相关选择压力的不同适应机制。
3. HLA-II 相关 HIV-1 适应的机制：研究人员通过酶联免疫斑点（ELISpot）IFN-γ 回忆反应试验对 16 名 HLA-DRB1 多样的慢性经治疗的 HIV-1 clade B 感染受试者进行初步筛选，确认了 15 个 HLA-II 限制性表位。在这些表位中，大多数适应肽（9/15）表现出 IFN-γ 产生减少，少数（2/15）表现出增加，还有部分（4/15）表现出混合反应。这表明 HIV-1 对 HLA-II 限制性 CD8⁺和 CD4⁺T 细胞介导的免疫压力的适应机制可能与对 HLA-I 限制性 CD8⁺T 细胞的适应机制相似。
4. 对适应的 HLA-II 限制性肽池反应的 T 细胞的功能状态：通过对 5 名 HLA-DRB103⁺和 / 或 HLA-DRB107⁺的慢性未经治疗的 HIV-1 clade B 感染受试者的激活的 CD4⁺和 CD8⁺T 细胞进行批量 RNA 测序（RNA-seq），研究人员发现，对适应的 HLA-II 限制性肽池反应的 CD8⁺T 细胞中，有 101 个基因富集，相关通路涉及细胞应激管理、RNA 代谢、T 细胞受体（TCR）信号传导和核孔复合体动力学等；而对非适应肽池反应的 CD8⁺T 细胞中只有 4 个与 RNA 代谢或表观遗传修饰相关的通路。在 CD4⁺T 细胞中，对适应肽池反应的细胞有 67 个基因富集，主要涉及蛋白质转运、定位和修饰；对非适应肽池反应的细胞有 222 个基因上调，相关通路涉及抗病毒免疫、细胞信号传导等。此外，对适应肽池反应的 CD4⁺和 CD8⁺T 细胞均表现出功能障碍的特征，如 CD8⁺T 细胞中 IRF4 和 IDO1 上调、TNFRSF4/OX40 下调，CD4⁺T 细胞中 NR4A1 和 PTGER4 富集。
5. CD4⁺和 CD8⁺T 细胞识别适应和非适应 HLA-II 限制性肽池的交叉反应性差异：对与 RNA-seq 检测相同的激活的 CD4⁺和 CD8⁺T 细胞进行批量 TCR 测序（TCR-seq），结果显示，CD4⁺和 CD8⁺T 细胞的 TCR 多样性、均匀性和克隆性在适应和非适应肽池反应之间无显著差异，但大多数受试者的 TCR repertoire 高度克隆化。在个体内，CD4⁺T 细胞对适应和非适应 HLA-II 限制性肽池的交叉反应性有限，而 CD8⁺T 细胞的交叉反应性较高。此外，研究还发现，CD4⁺和 CD8⁺T 细胞在识别相同的 HLA-II 限制性肽池时，TCRβ CDR3 基序在个体内和个体间高度一致，且 TRBV7 家族在多个受试者的 CD4⁺和 CD8⁺T 细胞中均有过表达。
6. HLA-II 相关 HIV-1 适应位点与 HLA-I 相关选择压力的重叠：研究人员对 HIV-1 clade B 基因组中 HLA-II 相关的适应位点进行映射，发现 52%（78/149）的 HLA-II 相关免疫压力位点也受到 HLA-I 相关免疫压力的影响。其中，58%（45/78）的重叠位点受到多个 HLA-I 位点（HLA-A、HLA-B 和 / 或 HLA-C）的选择压力，这些位点应避免用于疫苗免疫原设计。部分重叠位点与已知的祖先单倍型相关，这可能反映了病毒通过单一多态性同时逃避 HLA-I 和 HLA-II 相关免疫压力的情况。
7. HLA-II 相关 HIV-1 适应对疾病结局的影响：研究人员利用 HLA-II 相关 HIV-1 适应列表和已有的 HLA-I 相关适应列表，对 WA HIV 队列研究中的受试者进行分析。结果发现，在 Gag 蛋白中，HLA-I 相关 HIV-1 适应与病毒载量呈正相关，与 CD4⁺T 细胞计数呈负相关；当考虑 HLA-II 相关适应时，这种相关性进一步增强。这表明 HLA-II 相关适应可能影响 HIV-1 感染的临床结局，将其纳入现有病毒适应模型可能有助于提高对疾病进展的预测能力。
8. HLA-II 相关 HIV-1 适应在人群水平的积累：研究人员获取了西澳大利亚州 HIV 感染受试者血浆中的 Gag、Pol 和 Nef 序列，对 1992 - 2002 年和 2017 - 2022 年两个时间段的 clade B 序列进行分析。通过 FDR 校正的 Fisher 精确检验，发现 11 个位点的氨基酸频率在两个队列之间发生了显著变化，其中 7 个位点被预测仅受 HLA-II 相关免疫压力影响，且 71%（5/7）的这些位点在 2017 - 2022 年队列中的 HLA-II 相关适应增加。这表明 HLA-II 相关 HIV-1 适应可以在循环 HIV-1 毒株中积累，预适应的 HIV-1 毒株的传播可能会影响临床症状、患者预后和清除潜伏病毒库的努力。

讨论

在过去的四十多年里，研发安全有效的 HIV-1 疫苗一直是全球健康领域的重要目标。近期新冠疫苗的成功研发为 HIV-1 疫苗的研究带来了新的希望，联合 T 细胞和 B 细胞的疫苗策略被认为是最有前景的方法。强大的 CD4⁺T 细胞反应，尤其是来自 T 滤泡辅助细胞的反应，对于增强 HIV-1 抗体产生和引发强烈的抗 HIV-1 疫苗反应至关重要。同时，CD4⁺和 CD8⁺T 细胞都可以作为疫苗介导免疫的直接效应细胞，特异性地清除被 HIV 感染的细胞。然而，HIV-1 逃避 CD4⁺和 CD8⁺T 细胞的能力是疫苗和免疫控制的主要障碍，病毒的适应性突变会直接削弱 T 细胞反应，间接限制抗体产生，从而降低疫苗的有效性。此外，HLA 相关的 HIV-1 适应在循环 HIV-1 毒株中的流行率不断增加，这也给疫苗设计带来了挑战，因为源自近期循环毒株的疫苗免疫原可能包含适应的 T 细胞表位，从而影响疫苗效果。

本研究全面探讨了 HIV-1 clade B 对 HLA-II 限制性 T 细胞的适应情况，鉴定出 149 个 HLA-II 相关的适应位点，这些位点分布在整个 HIV-1 蛋白质组中，且超过一半的位点同时受到 HLA-I 限制性 CD8⁺T 细胞的压力，这表明这些区域不适合用于疫苗免疫原设计。研究还发现，适应的 HLA-II 限制性肽可以引发不同的 IFN-γ 反应，反映了 HIV-1 的不同适应机制；对适应肽池反应的 T 细胞表现出功能障碍的转录特征，CD4⁺和 CD8⁺T 细胞在 TCR 克隆型动力学上存在差异。这些结果强调了在疫苗设计中考虑病毒预适应（包括对 HLA-I 和 HLA-II 的适应）的重要性，有助于推动 HIV-1 治愈的研究进展。

然而，本研究也存在一些局限性。RNA-seq 和 TCR-seq 检测的样本量有限，这是该领域研究面临的普遍挑战。由于 HLA-II 限制性 T 细胞反应频率较低且幅度较小，加上需要合适的限制性 HLA 等位基因、对肽池有反应以及有足够数量的反应细胞等条件，使得样本量的扩大受到限制，这也凸显了研究 HLA 限制性 HIV-1 适应的难度。

材料和方法

1. 伦理声明：所有受试者均签署了知情同意书，同意参与研究并提供匿名样本。研究获得了皇家珀斯医院伦理委员会、默多克大学人类研究委员会、西澳大利亚大学和范德堡大学医学中心的批准，研究过程遵循世界医学协会《赫尔辛基宣言》的伦理准则。
2. 研究对象：遗传队列方面，使用了两个慢性 HIV-1 clade B 队列的已发表病毒序列和 HLA 基因分型数据，包括 ACTG 协议 A5142 和 A5128 中的 555 名治疗前受试者，以及 WA HIV 队列研究中的 245 名治疗后受试者。细胞免疫学队列方面，从范德堡综合护理中心和 WA HIV 队列研究中分别获取了 18 名未接受过治疗和 16 名接受过治疗的慢性 HIV-1 clade B 感染受试者的血浆和外周血单个核细胞（PBMC）样本。
3. HLA 基因分型和病毒测序：对 TN 队列进行高分辨率 HLA 基因分型（HLA-A、HLA-B、HLA-C 和 HLA-DRB1），采用特定的 DNA 提取、PCR 扩增和测序方法，并利用 IPD-IMGT/HLA 等位基因数据库进行数据分析。同时，对 TN 队列的 Gag、Pol 和 Nef 基因进行深度 HIV-1 病毒测序，包括 RNA 提取、逆转录 PCR、嵌套 PCR、测序和数据分析等步骤。
4. 检测 HLA-II 相关逃避突变：使用两种统计方法检测 HIV-1 clade B 基因组中 HLA-II 介导的免疫压力。“位点聚焦检测” 通过 Fisher 精确检验评估 HLA-II 等位基因与 HIV 基因组每个残基的氨基酸分布之间的关联，“多态性聚焦检测” 利用系统发育校正的逻辑回归模型确定特定 HLA-II 等位基因与氨基酸多态性之间的关联。两种方法结合共发现 149 个可能受 HLA-II 介导免疫压力影响的位点。
5. 肽设计与合成：利用 NetMHCII 网络算法，基于 HLA-II 相关免疫压力位点设计并合成了假定的 HLA-II 限制性 T 细胞表位肽，包括共识肽和最多三个变体 “适应” 肽。
6. 抗原诱导的细胞内细胞因子染色：通过抗原诱导的细胞内细胞因子染色检测 TN 队列中 HLA-II 限制性肽特异性 T 细胞反应，评估 IFN-γ 的产生。实验包括 PBMC 的处理、刺激、染色以及样本的获取和分析等步骤，阳性反应的判断有明确的标准。
7. IFN-γ 酶联免疫斑点试验：采用改良的方法对 WA 队列中 HLA-II 限制性肽特异性 T 细胞反应进行 IFN-γ ELISpot 检测，包括 PBMC 的处理、平板的准备、细胞的培养和检测等步骤。在确认试验前，部分样本会进行 CD8⁺T 细胞的去除，以评估 CD4⁺T 细胞的反应。
8. PBMC 刺激和分选：对冷冻保存的 PBMC 进行刺激，然后用多种单克隆抗体染色，通过荧光激活细胞分选仪（FACS）对激活的 CD4⁺（CD25⁺CD69⁺）和 CD8⁺（CD69⁺CD137⁺）T 细胞进行分选，并将其转移到裂解缓冲液中冷冻保存。
9. 批量 TCR 测序及数据分析：采用改良的 Smart-seq2 方法制备 TCR 文库，进行测序和数据分析。数据分析包括数据处理、CDR3 序列比对、质量控制以及对 CDR3 序列长度、TCR 多样性和库重叠的分析等，使用了多种软件和 R 语言包。
10. 批量 RNA 测序及数据分析：利用 TCR-seq 试验中的部分双链 cDNA 进行 RNA-seq 文库制备和测序，对测序数据进行质量过滤、比对和分析。分析内容包括基因特异性读数计数、标准化、差异基因表达分析、通路分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）等，使用了多个 R 语言包。
11. 与 HIV-1 疾病结局临床指标的相关性分析：对 WA HIV 队列研究中符合条件的受试者进行病毒适应分析，计算病毒适应水平，并与临床指标（病毒载量和 CD4⁺T 细胞计数）进行 Spearman 秩相关分析。
12. 西澳大利亚州不同时期循环 HIV-1 毒株的研究：获取西澳大利亚州 1992 - 2002 年和 2017 - 2022 年的 HIV-1 序列数据，进行 RNA 提取、cDNA 转换、PCR 扩增、测序和数据分析。数据分析包括序列比对、亚型鉴定、数据过滤和统计检验等，以确定氨基酸频率的变化情况。