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本文聚焦有机阴离子转运蛋白（OATs）家族中的 OAT1，通过冷冻电镜解析其与抗病毒药西多福韦、糖尿病药格列本脲复合物结构，揭示药物识别机制，为 OAT1 相关药物研发、药物相互作用研究及精准医疗提供关键结构基础 。
引言
有机阴离子转运蛋白（OATs）属于溶质载体 22（SLC22）超家族，是一类跨膜蛋白，在多种组织中表达，参与内源性和外源性物质的生理清除过程。OATs 底物特异性广泛，其功能异常与多种代谢疾病和遗传性疾病相关。
OAT1（SLC22A6）主要定位于肾近端小管细胞基底外侧膜，在药物转运和代谢中发挥关键作用。它能运输多种临床药物，如抗 HIV 药物、抗肿瘤药物、抗生素等，同时也会转运有害化合物。OAT1 功能障碍会影响药物清除效率，导致药物在体内蓄积，增加药物毒性风险，还与慢性肾病等疾病的发生发展密切相关。其转运机制是通过与细胞内二羧酸（如 α - 酮戊二酸）交换有机阴离子，而细胞内 α - 酮戊二酸浓度由代谢过程和钠偶联转运体维持。
以抗病毒药西多福韦和治疗 2 型糖尿病的格列本脲为例，西多福韦经肾脏主动分泌，可能通过 hOAT1 转运，其主要剂量限制性毒性为肾毒性，常与丙磺舒联合使用以降低毒性；格列本脲通过阻断胰腺 β 细胞中 ATP 敏感的 K?通道诱导胰岛素分泌，但临床联合用药可能导致低血糖，丙磺舒会抑制其肾分泌。因此，深入研究 OAT1 对理解药物药代动力学、药物相互作用（DDIs）以及开发更有效的治疗方案至关重要。
虽然对 OCT1、OCT3 以及大鼠 OAT1 的研究为理解转运蛋白结构和功能提供了一定基础，但由于大鼠 OAT1 与人 OAT1（hOAT1）在药物相互作用谱上存在差异，且 hOAT1 底物识别的精确机制尚不清楚，限制了针对 hOAT1 的特异性抑制剂开发。本研究旨在通过纯化 hOAT1，利用冷冻电镜（cryo - EM）技术解析其与临床相关药物复合物的结构，结合突变功能研究和分子动力学（MD）模拟，揭示 hOAT1 的底物识别机制，为开发特异性抑制剂提供结构基础。
结果
- hOAT1 的纯化与表征：研究人员筛选多种温和非离子型去污剂，发现 n - 十二烷基 - β - d - 麦芽糖苷（DDM）与胆固醇半琥珀酸酯（CHS）组合可有效提取 hOAT1。通过荧光尺寸排阻色谱（SEC）和与单体 rOAT1 的洗脱位置对比，证实 hOAT1 在 DDM/CHS 存在下呈单体形式，且纯化后的 hOAT1 单分散性良好。
利用 6 - 羧基荧光素（6 - CF）作为 OAT1 的荧光底物，在人胚肾（HEK）293/hOAT1 细胞中进行细胞转运实验，结果显示 hOAT1 对 6 - CF 的摄取具有特异性，其 K?值为 13.7 μM，与文献报道相符。使用西多福韦和格列本脲两种药物评估其与 hOAT1 的相互作用，发现它们均能剂量依赖性地抑制 6 - CF 的摄取，半最大抑制浓度（IC??）分别为 140.8 ± 32.6 μM 和 2.4 ± 0.8 μM，表明这两种药物与 hOAT1 有较强相互作用。2. apo hOAT1 的结构测定：对 apo hOAT1 进行单颗粒冷冻电镜重构，获得分辨率为 3.36 ? 的密度图。通过颗粒挑选和二维、三维分类，确定 hOAT1 以单体形式存在。其结构可分为跨膜结构域（TMD）、细胞内结构域（ICD）和细胞外结构域（ECD），TMD 由 12 个跨膜螺旋组成，采用主要促进超家族（MFS）的保守折叠，ICD 由七个螺旋组成，ECD 包含四个 N - 连接糖基化位点，功能有待进一步阐明。基于结构特征，hOAT1 还可分为 N 端结构域（NTD）和 C 端结构域（CTD）。在中央结合位点观察到非蛋白质密度，推测为内源性配体，但因分辨率限制无法确定其具体身份。与已知 rOAT1 和其他转运体结构对比，确定 apo hOAT1 为向内开放构象。3. 西多福韦和格列本脲识别的结构基础：分别解析 hOAT1 与西多福韦和格列本脲复合物的结构，分辨率分别为 3.15 ? 和 3.68 ?。西多福韦结合的 hOAT1 呈向内构象，底物口袋完全暴露于细胞质，对细胞外关闭。西多福韦在中央结合位点呈 “松散” 结合状态，其核苷基团与 Tyr23?（TM5）和 Phe?3?（TM10）形成芳香 π - π 相互作用，羟基与 Tyr3?3（TM7）的羟基形成氢键，氨基与 Ser231（TM5）和 Asn?3?（TM10）相互作用。通过对结合位点相关氨基酸进行突变研究，发现 Ser231Ala 和 Phe?3?Tyr 突变体的转运活性降低，IC??值增加，进一步证实这些残基参与西多福韦的结合。
格列本脲结合的 hOAT1 也呈向内构象，其在 hOAT1 中央腔顶点呈 U 形结合，结合口袋由 TM1、TM4、TM5、TM7、TM10 和 TM11 形成。格列本脲的苯甲酰胺基团向 TM10 和 TM11 延伸，磺脲基团与 TM1 和 TM5 相互作用，环己基部分突出到 TM1 和 TM11 之间的腔中。关键结合位点残基包括 Asn3?、Ser2?3、Met2??、Tyr23?、Tyr3?3、Tyr3??、Phe?3?、Phe??2、Ser??2 和 Arg???。对这些残基进行突变分析，发现 Ser??2Ala 和 Arg???Ala 突变体转运活性大幅降低，Met31Ala、Tyr3??Ala 和 Phe??2Ala 突变体与格列本脲的结合亲和力下降，Tyr23?Phe 突变体的 IC??值增加，表明这些残基在格列本脲结合中起重要作用。
比较西多福韦和格列本脲的结合位点，发现它们结合于同一口袋，但格列本脲与 hOAT1 的相互作用更广泛，这可能是其结合亲和力比西多福韦高约 60 倍的原因。同时，两种药物均未完全占据结合口袋，体现了 hOAT1 底物结合的多特异性。4. 配体结合的保守芳香残基：为研究 hOAT1 向内和向外构象的转变，基于 hOCT1 和 hOCT3 的外向结构构建 hOAT1 外向模型。与向内构象相比，NTD 相对刚性，CTD 变化显著，细胞外侧 TM7、TM9、TM10、TM11 和 TM12 向中央结合口袋移动，关闭细胞外通路；细胞内侧 TM7、TM8、TM9、TM10 和 TM11 远离腔室，打开通向细胞质的通道，TM12 细胞内部分位移最小。
在 hOAT1 结合位点，存在一组保守的芳香残基，如 Tyr3?3、Phe??2、Tyr23?、Trp3??和 Phe?3?，它们在配体结合和转运中起关键作用。Tyr3?3 和 Phe??2 分别作为细胞外和细胞内的 “门”，突变会导致转运活性丧失或降低。Tyr23?参与配体结合，其突变体无活性；Trp3??和 Phe?3?突变也会降低转运活性。这些保守芳香残基形成的相互作用网络在不同 SLC22 转运体中具有相似性，部分解释了不同转运体在配体选择性上的重叠。
讨论
SLC22 家族包含 30 多种转运蛋白，负责有机阳离子（OCTs）、阴离子（OATs）和两性离子的转运，对药物和外源性物质的药代动力学有重要影响。OAT1 在肾脏药物排泄和药物相互作用中起关键作用，抑制 OAT1 可改变药物疗效、降低毒性，开发特异性 OAT1 抑制剂有助于精准医疗。
本研究通过冷冻电镜解析 hOAT1 及其与两种药物复合物的结构，发现 hOAT1 在 DDM/CHS 存在下为单体，两种药物结合于中央大结合位点，部分重叠。中央结合位点由保守的芳香和疏水残基组成，对配体识别至关重要，突变这些残基会影响转运活性和配体结合亲和力。
此前对 hOCT1 和 hOCT3 不同构象的研究为理解交替 access 机制提供了框架，hOAT1 可能遵循类似机制，CTD 结构域的运动伴随中央口袋的开放和关闭。本研究虽确定了部分参与配体结合的残基，但深入了解 hOAT1 外向构象结构对阐明其转运机制更有帮助。
总之，本研究揭示了 hOAT1 与临床相关药物的结构相互作用，为药物设计、预测药物相互作用以及优化药物剂量提供了理论依据，有助于推动合理用药和药物研发。
