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本文开发了一种双盘结构的嵌合修复贴片（CRP）用于治疗气管瘘（TF）。CRP 基于双交联丝素蛋白（SF）网络，具有良好性能，能有效修复 TF。在此基础上开发的上皮化 CRP（E-CRP）可促进原位再上皮化，且个性化 CRP 有望经支气管镜无创植入，为 TF 治疗带来新希望。
### 研究背景
气管瘘（TF）是一种严重的胸部疾病，死亡率高。目前的治疗方法，如手术闭合和支架封堵，存在诸多问题。手术过程复杂，术后易出现感染、水肿、纤维化等并发症，且修复效果不持久；支架治疗虽能快速缓解症状，但存在密封率低、支架移位断裂、瘘口闭合不完全、管腔内新生内膜增生和修复部位再上皮化困难等挑战。因此，临床急需一种可生物降解的支架，能实现 TF 的快速稳定闭合，并促进组织再生和上皮化。
丝素蛋白（SF）是一种天然高分子纤维蛋白，具有良好的生物相容性、低免疫反应、促进细胞生命活动、利于氧气和营养运输、加速上皮再生等特性，在组织修复领域有广泛应用前景。本研究旨在开发一种基于 SF 的嵌合修复贴片（CRP），解决 TF 治疗难题，并进一步开发上皮化的 CRP（E-CRP），增强再上皮化效果。
CRP 的制备与表征
为应对 TF 的临床难题，研究人员开发了双盘状 CRP。制备时，先将四层穿孔亚克力板堆叠组装成模具，再将含交联剂的 SF 水溶液（5.0%，w/v）倒入模具，在冷冻环境下进行 β 片层和交联反应，形成化学交联网络，制备出多孔支架。经冷冻、交联、解冻、洗涤、冻干等步骤，可批量获得双盘状 CRP。这种制备方法能根据不同组织缺陷制作各种几何形状的 CRP，具有低成本、大规模、标准化制备的潜力。
通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析、X 射线衍射实验、扫描电子显微镜（SEM）观察等手段对 CRP 进行表征。FTIR 光谱显示，CRP 中酰胺 I 和 II 吸收带向低波数移动，证明了交联剂与 SF 的双重交联；X 射线衍射实验表明，CRP 具有典型的 β 片层晶体结构。SEM 图像显示，CRP 具有多级微孔结构，内部相互连通的大孔直径为 72.24±17.02μm，表面微孔直径为 10.19±2.00μm，孔隙率高达 94.63±2.18%。大孔利于周围组织向内生长和血管再生，表面微孔则促进细胞黏附和生长。此外，CRP 还具有良好的亲水性和吸水性，最大吸水率达 725.2±31.4%。
CRP 在干湿状态下机械性能不同。干燥时，其刚度较大，模量为 545.3±43.4kPa；湿润时，模量降低至 15.5±2.6kPa，具有良好的弹性和抗疲劳性能。在循环压缩测试中，湿态 CRP 能在多次变形下保持结构稳定，这种柔软且有弹性的机械性能与软组织相似，有助于抵抗 TF 植入后的动态压力环境，维持结构完整性，促进瘘口闭合，防止渗漏。
无细胞 CRP 对 TF 的原位修复实现初步组织再生
为验证无细胞 CRP 修复 TF 的效果，研究人员建立了兔 TF 模型。在兔气管上制造一个 3mm 直径的缺陷模拟临床 TF，分别用 CRP 修复和传统手术缝合作为对照。
实验结果显示，CRP 组兔子的存活率显著提高。缺陷组兔子在 3 天内死亡率达 100%，缝合组在 2 - 3 周后存活率急剧下降，最终仅为 20%，多数死于严重化脓性继发感染；而 CRP 组存活率为 100%，兔子生命体征正常，饮食和精神状态良好。这可能得益于 CRP 的亲水性和快速止血功能，但其具体机制有待进一步研究。
修复 3 周后，内镜成像显示 CRP 在修复后仍保持稳定，而缝合组气管腔出现明显狭窄；X 射线和 CT 成像表明，缝合组气管狭窄明显，CRP 组气管通畅，但存在 CRP 降解不完全和组织再生不足的情况。组织学染色和免疫荧光（IF）染色结果显示，CRP 内部有组织细胞浸润，主要由胶原蛋白和纤维组成，具有良好的生物相容性；与缝合组相比，CRP 组成纤维细胞、黏液细胞浸润程度更高，血管生成更显著，上皮化水平也更高，但纤毛上皮化程度较低，再生上皮多为未分化状态。
修复 6 周后，CRP 组修复效果令人满意。X 射线和 CT 图像显示气管壁通畅，无明显狭窄，TF 缺陷在 CT 3D 重建中消失；支气管镜和解剖图像显示，CRP 组支气管内壁光滑连续，黏膜覆盖完整。组织学和 IF 染色结果表明，CRP 组组织形成丰富且有序，成纤维细胞、黏液细胞浸润更明显，再上皮化和纤毛化效果更好，血管生成程度更高。与手术缝合相比，CRP 修复具有诸多优势，如存活率高、感染风险低、狭窄率低、止血效果好、操作简便等，但单纯的无细胞 CRP 在再上皮化方面仍存在局限性，需要开发具有黏膜上皮功能的生物活性 CRP。
E-CRP 的构建与体外验证
为解决再上皮化难题，研究人员采用组织工程方法在体外重建 CRP 的人工黏膜上皮，开发出 E-CRP。呼吸道气管上皮由假复层纤毛柱状上皮组成，主要包含纤毛细胞、分泌细胞（主要是分泌黏液的杯状细胞）和基底细胞。在体外培养时，只能分离出气道基底细胞，且其增殖和分化能力有限。
研究人员从兔气管黏膜中提取气道基底细胞，在体外扩增后接种到 CRP 表面，然后利用气液界面系统（ALIS）模拟气道上皮的体内环境，诱导气道基底细胞分化为气道特异性假复层纤毛柱状上皮。通过光镜观察、IF 染色、活 / 死细胞染色、3D 荧光成像、扫描生物电子显微镜观察和基因表达分析等手段对 E-CRP 进行验证。
结果表明，体外分离和扩增的气道基底细胞纯度和活性良好，接种到 CRP 表面后能稳定黏附、存活和增殖。在 ALIS 中培养 21 天后，E-CRP 表面的气道基底细胞开始分化，出现类似纤毛的结构；组织学和 IF 染色显示，E-CRP 上的细胞紧密分布，形成了紧密连接，表达黏液细胞和纤毛柱状上皮的特征蛋白；基因表达分析表明，ALIS 培养促进了气道基底细胞向杯状细胞和纤毛细胞的分化，下调了基底细胞基因表达，上调了杯状细胞和纤毛细胞基因表达。这表明 E-CRP 在体外成功再生了气道黏膜上皮，在结构和功能上均得到验证，具有临床转化的潜力。
E-CRP 原位修复 TF 并促进再上皮化
为研究 E-CRP 对 TF 修复后再上皮化的促进作用，研究人员在兔 TF 模型中使用负载人工黏膜上皮的 E-CRP 进行修复实验。修复 6 周后，对气道黏膜的再上皮化和上皮纤毛化程度进行评估。
X 射线和 CT 成像结果显示，E-CRP 修复的 TF 区域气管壁通畅，与正常气管相似，无明显狭窄或间隙；支气管镜检查结果表明，E-CRP 修复区域的管腔内表面光滑连续，人工黏膜覆盖完整；解剖学大体图显示，修复区域与周围正常组织融合良好。组织学染色和 IF 染色结果显示，E-CRP 修复区域有大量组织浸润和胶原沉积，成纤维细胞和黏液细胞浸润明显，上皮修复能力显著增强，PCK 完全覆盖，FoxJ1 荧光强度比超过 100%，表明存在纤毛细胞。与自然气管相比，E-CRP 不仅实现了更好的再上皮化，还增强了上皮纤毛化。
综合比较 CRP 修复 3 周、6 周，E-CRP 修复 6 周和自然气管这四组的结果，发现 CRP 在修复 3 周时能有效修复气管结构和部分功能（不包括再上皮化），6 周时促进了修复区域的再上皮化；而 E-CRP 通过组织工程再生气道黏膜，显著增强了 CRP 的上皮修复效果，有效解决了 TF 修复过程中的再上皮化难题。目前，尚未有关于负载气道上皮细胞的支架修复 TF 的相关研究报道，与其他用于 TF 治疗的水凝胶相比，E-CRP 具有更好的机械性能和体外构建人工上皮的优势。
个性化 CRP 修复山羊 TF 模型及无创植入探索
在兔模型中 E-CRP 治疗 TF 取得成功后，研究人员将研究拓展到大型动物模型，并探索临床转化应用。由于 TF 患者的瘘口大小、形状和位置存在差异，个性化 CRP 能更好地满足个体需求，提高支架与 TF 的兼容性。
研究人员通过 CT 3D 重建技术和 3D 打印模具制备个性化 CRP。选取一位典型 TF 患者，对其 TF 及周围组织结构进行 3D 重建，根据患者的独特形态和特征开发个性化模型，然后用模具制备方法获得与实际 TF 完美匹配的 CRP。这种方法制备的 CRP 尺寸和形状多样，制备过程安全、高效、便捷，具有良好的临床应用前景。
为研究 CRP 对大型动物 TF 模型的修复效果，研究人员在山羊损伤模型中使用个性化 CRP 进行修复实验。在山羊气管上制造个性化缺陷模拟临床 TF，用个性化 CRP 进行修复。4 周后，CT 成像显示气管壁光滑通畅，无明显狭窄或间隙；支气管镜和解剖图显示，修复区域的管腔内表面光滑连续，黏膜完全再生，CRP 的内盘与周围正常组织融合，外盘保持完整。组织学和 IF 染色结果表明，CRP 修复区域有大量组织浸润和胶原沉积，成纤维细胞、黏液细胞浸润明显，血管生成程度高，上皮修复能力强，PCK 完全覆盖，FoxJ1 荧光强度可观，且 CRP 在修复过程中未引发严重的免疫炎症反应。这表明 CRP 能有效促进山羊 TF 缺陷的组织再生和再上皮化，验证了 CRP 在大型动物 TF 修复中的显著治疗和修复效果，凸显了其临床应用和转化潜力。
研究人员还对 CRP 在人体气管中的修复环境进行了理论计算和有限元分析。结果表明，在呼吸过程中，CRP 能在气管内不同压力条件下保持结构稳定和完整性，增强修复效果。此外，CRP 具有出色的弹性，可压缩装入支气管镜的工作通道，到达瘘口位置后能迅速恢复原状进行封堵。研究人员通过体外模拟支气管镜介入手术，验证了无创修复的可行性。在临床应用中，可在体外构建上皮化的定制 E-CRP，通过支气管镜和成像定位技术精确植入瘘口进行无创修复，展现了 E-CRP 在临床应用中的巨大潜力。
研究展望
传统手术治疗 TF 创伤大、并发症多，现有支架存在诸多问题。本研究设计合成的 CRP 具有独特优势，E-CRP 进一步增强了再上皮化效果，个性化 CRP 结合支气管镜技术有望实现无创高效的 TF 修复。然而，CRP 在 TF 修复应用中仍面临挑战，如对于大缺陷需增强机械性能，实现气管软骨和上皮黏膜的双重修复等。未来研究应聚焦于优化 CRP 的制备工艺和生物学特性，探索与其他生物材料和生物分子的协同作用，开展临床前转化研究，为 TF 患者提供更安全有效的治疗方案。
