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为探究蛋白酶体基础表达调控机制及 DYT6 型肌张力障碍发病机制，东京大学等单位研究人员开展 THAP1 相关研究。发现 THAP1 调控 PSMB5 表达影响蛋白酶体活性，该成果为理解疾病机制提供新思路，值得科研人员阅读。
DYT6 型肌张力障碍致病蛋白 THAP1 通过调控 PSMB5 转录影响蛋白酶体活性
接收日期：2024 年 6 月 25 日
作者：Yan Wang、Yi Wang、Tomohiro Iriki、Eiichi Hashimoto、Maki Inami、Sota Hashimoto、Ayako Watanabe、Hiroshi Takano、Ryo Motosugi、Shoshiro Hirayama、Hiroki Sugishita、Yukiko Gotoh、Ryoji Yao、Jun Hamazaki、Shigeo Murata
单位信息：
- 东京大学药学研究生院蛋白质代谢实验室，东京文京区，日本
- 宁波大学附属康宁医院，浙江宁波庄俞南路 1 号
- 东京大学药学研究生院未来药物发现一站式共享设施中心，东京文京区，日本
- 日本癌症研究基金会癌症研究所细胞生物学系，东京江东区，日本
- 东京大学药学研究生院分子生物学实验室，东京文京区，日本
- 东京大学国际神经智能研究中心（WPI - IRCN），东京文京区，日本
- 共同第一作者：Yan Wang、Yi Wang
通讯作者邮箱：smurata@g.ecc.u-tokyo.ac.jp
录用日期：2025 年 2 月 4 日
在线发表日期：2025 年 2 月 14 日
更新情况查询：[具体链接]
蛋白酶体在蛋白质降解过程中发挥着关键作用，其功能受损与多种病理状况相关，其中就包括神经退行性疾病。目前已知，Nrf1 能够在蛋白酶体功能异常时，协调所有蛋白酶体基因的诱导表达。然而，调节蛋白酶体基础表达的分子机制仍不明确。在此项研究中，东京大学药学研究生院蛋白质代谢实验室等单位的研究人员通过全基因组遗传筛选，确定了转录因子 THAP1（DYT6 型肌张力障碍的致病基因）为蛋白酶体活性的调节因子。研究表明，THAP1 能够直接调控编码核心蛋白酶亚基 β5 的 PSMB5 基因的表达。THAP1 缺失会破坏蛋白酶体的组装，导致蛋白酶体活性降低以及泛素化蛋白的积累。这些研究结果揭示了一种蛋白酶体的调控机制，并表明蛋白酶体功能障碍在肌张力障碍发病机制中可能具有潜在作用。
泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）在真核生物中广泛存在且高度保守，负责降解泛素化的蛋白质。通过 UPS 进行的蛋白质代谢在调节细胞的关键活动以及维持细胞内环境稳定方面起着核心作用，其作用过程涵盖细胞周期、信号转导、DNA 修复以及蛋白质质量控制等多个方面。经由泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）的作用，一系列与赖氨酸 48 相连的泛素分子会共价结合到靶蛋白上，这一修饰作为主要信号，可被 26S 蛋白酶体识别。
26S 蛋白酶体是一种大型的多亚基蛋白酶复合物，它以 ATP 依赖的方式降解泛素化蛋白。26S 蛋白酶体由一个中央的 20S 核心颗粒（CP）和位于其一端或两端的 19S 调节颗粒（RP）组成。CP 负责蛋白酶解活性，呈圆柱形结构，由 α1 - 7 亚基组成的 α 环和由 β1 - 7 亚基组成的 β 环按 α - β - β - α 的顺序同轴重叠。α 环充当底物蛋白进入 CP 的通道，这些底物蛋白会被 RP 展开。β1、β2 和 β5 亚基分别具有类半胱天冬酶、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶的活性，赋予了蛋白酶体切割肽键和降解进入 CP 的底物蛋白的能力。RP 又可分为两个亚复合物，即基座（base）和盖子（lid）。基座由六个不同的同源 AAA - ATP 酶亚基（Rpt1 - 6）和三个非 ATP 酶亚基（Rpn1、Rpn2 和 Rpn13）组成，而盖子则由九个非 ATP 酶亚基（Rpn3、Rpn5 - 9、Rpn11 - 12 和 Rpn15）构成。已有众多蛋白质被证实能够调节 26S 蛋白酶体的生物合成和功能。蛋白酶体的组装由多种特定的伴侣蛋白介导，例如在 CP 组装过程中起作用的 PAC1/Pba1、PAC2/Pba2、PAC3/Pba3、PAC4/Pba4 和 POMP/Ump1，以及在 RP 组装中发挥作用的 S5b/Hsm3、p27/Nas2、p28/Nas6 和 PAAF1/Rpn14。在多细胞生物中，转录因子 Nrf1 及其同源物能够在蛋白酶体受到抑制时，协调所有蛋白酶体亚基基因的表达。鉴于大多数研究蛋白酶体的遗传方法都是在酿酒酵母中进行的，而在多细胞生物中蛋白酶体的调控机制愈发多样和复杂，并且与蛋白酶体功能障碍相关的人类疾病也逐渐被认知，因此探索哺乳动物中蛋白酶体的调控机制显得尤为重要。
普遍认为，蛋白酶体功能障碍会破坏细胞内环境稳定，进而促使多种疾病的发生发展，并加速机体衰老。例如，有研究报道，老年生物体内蛋白酶体活性下降，导致异常且可能有害的蛋白质积累。此外，蛋白酶体亚基的突变也被证实具有致病性。PSMC3 基因的内含子纯合变异以及 PSMD12 基因的杂合新生无义突变已被报道可引发神经发育障碍。同样，在患有自身炎症性疾病和免疫缺陷疾病的患者中，也发现了 PSMB8（PSMB8G197V/G197V）的突变和 PSMB9（PSMB9G1504）的杂合变异。相反，研究表明增强蛋白酶体活性能够延长线虫和果蝇的寿命。过表达 β5 亚基可延长果蝇的寿命，这归因于活性蛋白酶体数量的增加，因为已有研究显示，在人类细胞中过表达 β5 亚基会使组装好的蛋白酶体数量增多，这凸显了 β5 在蛋白酶体功能中的重要性。显然，对蛋白酶体功能的调节具有重要的生物学意义。然而，目前对于蛋白酶体调节的详细分子机制仍未完全明晰。
为了全面深入地了解调控蛋白酶体功能的机制，东京大学药学研究生院蛋白质代谢实验室等单位的研究人员开展了全基因组 CRISPR 敲除筛选实验。通过该实验，研究人员鉴定出转录因子 THAP1 为蛋白酶体的调节因子。THAP1 是 THAP 家族转录因子的成员，据推测其参与神经元发育、髓鞘形成以及 DNA 修复等过程。THAP1 的多个突变与 DYT6 型肌张力障碍相关，这是一种神经系统疾病，其特征为运动时出现不自主的肌肉收缩或异常姿势。尽管如此，THAP1 的哪个靶基因导致 DYT6 型肌张力障碍的发病机制仍不清楚。研究人员发现，THAP1 敲除会致使 CP 组装缺陷，进而引起蛋白酶体活性降低以及泛素化蛋白积累。进一步研究揭示，THAP1 敲除会特异性地降低 β5 亚基的表达，而对其他蛋白酶体亚基的表达没有影响。研究还表明，THAP1 能够结合到 PSMB5 的启动子区域，从而调控蛋白酶体活性。这些结果暗示了蛋白酶体功能障碍与肌张力障碍发病机制之间可能存在潜在联系。
研究结果
通过全基因组筛选鉴定 THAP1 为蛋白酶体的调节因子
为了鉴定蛋白酶体的调节因子，研究人员采用了全基因组 CRISPR 敲除筛选技术。为了监测蛋白酶体功能障碍，研究人员使用了一种人工合成蛋白，即融合了荧光蛋白 ZsGreen 的小鼠鸟氨酸脱羧酶（mODC）降解结构域（氨基酸 410 - 461），命名为 ZsGreen - mODC。在正常稳定状态下，ZsGreen - mODC 翻译后会持续被降解，而在蛋白酶体功能受损时会发生积累，进而呈现绿色荧光（补充图 1a）。研究人员构建了稳定表达 mCherry - P2A - ZsGreen - mODC 的 U2OS 细胞系，以监测因基因敲除导致蛋白酶体活性降低的细胞，其中 mCherry 作为内参用于标准化构建体的表达水平。研究人员进行了基于流式细胞术的 CRISPR 敲除筛选（补充图 1b）。将稳健秩聚合（RRA）分数小于 0.01（对应 - Log10（RRA 分数）> 2）的前 557 个基因定义为阳性命中基因（图 1a）。蛋白酶体亚基被鉴定为顶级命中基因，这证实了该筛选方法的可靠性（图 1a 和补充图 1c）。在排名前 50 的基因中，除了蛋白酶体亚基外，THAP1 具有相对较高的 RRA 分数，并且此前尚未有研究报道其与蛋白酶体相关，因此它很可能是蛋白酶体的调节因子（补充图 1c）。
为了验证筛选结果，研究人员在表达 mCherry - P2A - ZsGreen - mODC 的 HEK293T 和 U2OS 细胞系中，分别表达了两种靶向 THAP1 的不同 sgRNA。THAP1 敲除导致 HEK293T（图 1b、c）和 U2OS（图 1d、e）细胞中 ZsGreen - mODC 显著积累，这一现象与敲除由 PSMA6 编码的 CP 亚基 α1 的细胞中所观察到的结果相当。研究人员还通过生化方法测定了蛋白酶体活性，发现 THAP1 敲除后蛋白酶体肽酶活性显著降低（图 1f 和补充图 1d）。为了确定 THAP1 敲除对蛋白酶体活性的影响，研究人员通过免疫印迹分析了细胞裂解物。与蛋白酶体活性下降相一致，THAP1 敲除导致泛素化蛋白明显积累（图 1g）。通过过表达对 sgRNA 具有抗性的 THAP1 cDNA，可以挽救因 THAP1 敲除导致的蛋白酶体活性降低和泛素化蛋白积累（图 1h、i 和补充图 1e）。这些结果表明，THAP1 是一种蛋白酶体调节因子。
THAP1 对蛋白酶体 CP 的组装至关重要
为了探究 THAP1 敲除导致蛋白酶体活性下降的机制，研究人员对 THAP1 敲除细胞的裂解物进行了免疫印迹分析，检测蛋白酶体亚基和组装伴侣蛋白。研究人员发现，β1 和 β2 亚基的前体发生积累，这些前体在 CP 组装完成后其前肽会被切割，同时其他 β 亚基（β3 - 7）显著减少，而 α 亚基和 RP 亚基受影响较小（图 2a 和补充图 2a）。此外，研究人员还观察到 CP 组装伴侣蛋白 PAC2 和 Ump1 的积累，这表明在 CP 组装过程中存在中间产物的堆积（图 2a）。这些结果表明，THAP1 敲除会导致蛋白酶体组装出现缺陷。
先前的研究已经详细阐述了 CP 的组装过程。首先形成 α 环，然后 β 亚基按照 β2、β3、β4、β5、β6、β1 和 β7 的顺序依次掺入，其中 β2、β5 和 β1 带有前肽，在 CP 组装完成时会被切除（图 2b）。
为了深入研究 THAP1 敲除对 CP 组装的具体影响步骤，研究人员通过甘油梯度离心对细胞裂解物进行分级分离，并对每个组分进行肽酶活性测定和免疫印迹分析。THAP1 敲除导致 20S 和 26S 组分中的蛋白酶体活性均下降（图 2c 和补充图 2b、c）。与此一致的是，在 THAP1 敲除细胞的 20S 和 26S 组分中，CP 亚基均减少（图 2d）。最显著的差异是 CP 组装中间产物的积累，表现为在比组装好的 CP（20S）更轻的组分（图 2d，8 - 12 组分）中，β2、β3 和 β4 的前体形式以及 α2 的含量增加。其他 β 亚基，如 β1、β5、β6 和 β7，在这些组分中几乎检测不到；相反，β1 的前体形式在更轻的组分中被发现，推测其处于未掺入 CP 组装中间产物的孤立亚基状态（图 2d，2 - 6 组分）。考虑到 CP 的组装过程（图 2b），这些结果表明 CP 组装能够进行到 β2、β3 和 β4 的掺入阶段，但 β5 及后续亚基的掺入受到严重影响，很可能是在 β5 掺入的过程中出现问题。在积累的组装中间产物以及更轻的组分中均未检测到 β5 的前体形式，这表明在 THAP1 敲除细胞中，β5 的表达是限速步骤。
THAP1 调节 PSMB5 的表达
由于 THAP1 被报道为具有 DNA 结合 THAP 结构域的转录因子，研究人员推测 THAP1 可能直接调节蛋白酶体亚基的转录过程。研究人员使用 RT - qPCR 技术检测了 THAP1 敲除细胞中蛋白酶体亚基和组装伴侣蛋白的 mRNA 水平。在检测的基因中，研究人员发现只有由 PSMB5 编码的 β5 的 mRNA 在 THAP1 敲除细胞中显著下降，而其他 β 亚基（图 3a）、α 亚基、RP 亚基以及组装伴侣蛋白的 mRNA 水平并未受到 THAP1 敲除的影响（补充图 3）。通过过表达对 sgRNA 具有抗性的 THAP1 cDNA，可以挽救因 THAP1 敲除导致的 β5 mRNA 水平下降（图 3b）。这些结果表明，THAP1 特异性地调节 β5 亚基的表达，而对其他亚基无此作用。
THAP1 已被证实参与神经发育相关基因的表达调控，但此前尚未发现其与蛋白酶体基因的表达存在关联。为了全面鉴定 THAP1 的主要转录靶点，研究人员对 THAP1 敲除细胞进行了 RNA - Seq 分析。研究人员证实，在蛋白酶体亚基中，只有 PSMB5 的表达在 THAP1 敲除细胞中下调（图 3c）。THAP1 敲除还影响了许多其他基因的表达。对 THAP1 敲除后下调基因的基因本体分析表明，THAP1 还参与核糖体生物发生和线粒体功能相关基因的调控（图 3d 和补充数据 1）。这些结果表明，THAP1 除了参与蛋白酶体功能调节外，还涉及多种细胞内环境稳定机制。
过表达 β5 可挽救 THAP1 敲除导致的蛋白酶体功能障碍
为了探究 THAP1 对蛋白酶体活性的调节是否通过调控 PSMB5 的表达来实现，研究人员在 THAP1 敲除细胞中瞬时过表达每个 β 亚基，持续 5 天。在所有 β 亚基中，只有过表达 β5 能够显著挽救蛋白酶体活性（图 4a）。过表达 β5 也能挽救因 THAP1 敲除导致的泛素化蛋白积累（补充图 4a）。研究人员通过甘油梯度离心对细胞裂解物进行分级分离，并进行肽酶活性测定和免疫印迹分析。结果显示，只有过表达 β5 能够恢复 20S 和 26S 组分中的蛋白酶体活性（图 4b 和补充图 4a、b），减少孤立 β1（补充图 4b，2 - 8 组分）和前体 β2（补充图 4b，10 - 14 组分）的积累，并增加组装好的蛋白酶体的数量（补充图 4b，22 - 26 组分）。
由于瞬时过表达 β5 可能因转染效率和过表达持续时间的原因，未能完全恢复 THAP1 敲除导致的蛋白酶体活性下降，研究人员构建了稳定表达 β5 - FLAG 的 HEK293T 细胞系，并进行 THAP1 敲除实验。稳定过表达 β5 几乎完全挽救了因 THAP1 缺失导致的蛋白酶体活性下降和泛素化蛋白积累（图 4c - e 和补充图 4c、d）。研究人员还观察到 β1（图 4e、f，2 - 10 组分）和 β2（图 4e、f，10 - 12 组分）的前体形式减少，并且外源 β5 - FLAG 蛋白能够有效掺入组装好的蛋白酶体中（图 4f，16 - 26 组分）。综上所述，这些结果表明，THAP1 对 PSMB5 表达的调控是维持蛋白酶体活性的关键因素。
THAP1 结合到 PSMB5 基因的上游序列
为了阐明 THAP1 对 PSMB5 转录调控的机制，研究人员分析了 ChIP - Atlas 数据库中公开的 ChIP - Seq 数据。研究人员发现，THAP1 在编码 β5、Rpn7 和 Rpn12 的基因上存在结合峰，其中 PSMB5 基因的上游序列结合频率尤为突出（图 5a），这与 THAP1 特异性调节 PSMB5 表达的结果相符。
进一步观察 PSMB5 基因上游的 ChIP - Seq 数据，发现在转录起始位点前后存在两个峰，并且在转录起始位点周围 500bp 的序列内共有三个假定的 THAP1 结合序列基序（NNTNNNGGCAN，N 代表任意核苷酸）（图 5b）。
为了研究这一约 1kb 区域对 PSMB5 表达的重要性，研究人员进行了荧光素酶报告基因实验。在荧光素酶 cDNA 上游添加该 1kb 序列后，相对荧光素酶活性增加（图 5b），而 THAP1 敲除导致荧光素酶活性下降（图 5c），这表明 THAP1 至少通过 PSMB5 基因上游 1kb 区域激活 PSMB5 的表达。
为了确定 THAP1 是否直接结合到 PSMB5 启动子区域，研究人员使用针对外源表达的 FLAG - THAP1 的 FLAG 抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验。研究人员发现，与对照细胞相比，表达野生型 THAP1 的细胞中 THAP1 与 PSMB5 启动子区域的结合显著增强（图 5d）。相反，致病性 THAP1 点突变体（C54Y）无法与 PSMB5 启动子区域共免疫沉淀（图 5d）。这些结果表明，THAP1 能够直接结合到 PSMB5 启动子区域，而与疾病相关的 THAP1 C54Y 突变体则无法
