3D 打印细胞适配纳米胶体水凝胶：开启临界骨缺损内源性成骨修复新征程

本文聚焦骨修复难题，研究的 3D 打印纳米胶体明胶甲基丙烯酰化（GelMA）水凝胶（nG 水凝胶），凭借独特纳米胶体结构，能诱导大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）迁移、分化，促进体内骨缺损修复，为骨修复临床转化提供新策略。

　　### 一、研究背景
在再生医学领域，修复关键骨缺损一直是个棘手难题。自体骨移植虽为 “金标准”，但存在供应不足、造成二次创伤、形状难以匹配缺损部位等缺陷。骨组织工程支架虽能填充骨缺损，却难以在缺损部位内部为细胞生长和分化营造理想微环境，限制了细胞功能和新骨形成。引导内源性干细胞浸润支架并增殖、分化，是高效修复关键骨缺损的重要途径，这对支架结构提出了特殊要求，如具备多孔、连通性好且能适应细胞活动的结构，同时还需促进干细胞向成骨细胞分化。纳米结构能影响细胞行为，在骨再生领域备受关注。基于此，本研究制备了一种 3D 打印纳米胶体 GelMA 水凝胶（nG 水凝胶），期望为骨缺损修复带来新突破。

二、材料和方法

1. 3D 打印过程：利用自建的基于数字光投影（DLP）的打印机进行 3D 打印实验。实验材料包括甲基丙烯酰化程度为 97% 的 GelMA、光引发剂苯基 - 2,4,6 - 三甲基苯甲酰基膦酸锂（LAP），以及 F68、聚环氧乙烷（PEO）等。通过将不同溶液按特定比例混合制备聚合物墨水，再经 DLP 打印、光交联等步骤得到不同水凝胶，打印含细胞的水凝胶时需在无菌条件下操作。
2. 3D 打印水凝胶的表征：运用超分辨率结构光照明显微镜（SIM）、场发射扫描电子显微镜（FE - SEM）、原子力显微镜（AFM）等多种显微镜技术对水凝胶的微观结构、形态、纳米几何形状进行表征；将水凝胶浸入模拟体液（SBF）后，用 FE - SEM / 能量色散光谱仪（EDS）分析其生物活性；使用流变仪评估水凝胶的机械性能；采用活 / 死染色和细胞计数试剂盒 - 8（CCK - 8）增殖试验检测细胞活力。
3. 细胞迁移和铺展：从 2 周龄雄性 Sprague - Dawley（SD）大鼠胫骨区域获取原代大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs），分别在水凝胶表面和内部培养 rBMSCs，通过 FE - SEM 和细胞骨架荧光染色评估细胞铺展和迁移能力。利用 SIM 记录 nG 水凝胶的微观结构动态变化。
4. 成骨活性：使用含地塞米松、β - 甘油磷酸、抗坏血酸的成骨诱导培养基培养 rBMSCs，通过碱性磷酸酶（ALP）染色、定量分析，茜素红染色（ARS），免疫细胞化学（ICC）染色，定量实时聚合酶链反应（qRT - PCR）等方法检测 rBMSCs 的成骨分化情况。
5. 机械转导相关因子的表达：通过 qRT - PCR 分析整合素 β1（itgb1）和粘着斑激酶（Ptk2）基因表达，利用蛋白质免疫印迹（WB）和 ICC 染色检测整合素 β1 和磷酸化粘着斑激酶（pFAK）的蛋白质表达。
6. 动物研究：动物实验遵循相关指南和委员会批准。将水凝胶植入小鼠背部评估体内降解性和生物相容性；在大鼠颅骨创建临界尺寸骨缺损模型，植入不同水凝胶，通过微计算机断层扫描（μCT）、组织学染色、免疫组织化学（IHC）染色评估骨再生情况。
7. 统计分析：数据以均值 ± 标准差表示，运用 SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析和 Student - Newman - Keuls 方法检验，P < 0.05 表示差异具有统计学意义。

三、研究结果

1. nG 水凝胶的制备和表征：成功制备出 nG 水凝胶，其具有个性化 3D 打印能力，能呈现各种复杂形状。nG 水凝胶外观呈白色不透明，具有纳米胶体结构，由相互连接的纳米球和孔隙组成，相比传统 G 水凝胶和多孔 GelMA（pG）水凝胶，其比表面积和粗糙度更大，能吸附更多 Ca²⁺，且微观结构具有动态性。
2. nG 水凝胶的生物相容性：体外实验中，nG 水凝胶培养的 rBMSCs 活力和增殖能力优于 G 水凝胶和 pG 水凝胶；体内实验显示，nG 水凝胶植入后周围组织无明显炎症，降解过程有利于骨再生。
3. 细胞适配的 nG 水凝胶促进 rBMSCs 迁移和铺展：rBMSCs 在 nG 水凝胶表面和内部的迁移、铺展能力均强于 G 水凝胶和 pG 水凝胶。nG 水凝胶的动态纳米胶体结构能适应细胞行为，细胞在其中可自由迁移和改变形态，孔隙也会发生扩张和融合。
4. 细胞适配的 nG 水凝胶增强 rBMSCs 的成骨分化：nG 水凝胶培养的 rBMSCs 成骨相关指标表现优异，如 ALP 活性显著增强、钙结节形成明显增多，成骨相关基因和蛋白表达上调，细胞形态更接近成骨细胞。
5. 细胞适配的 nG 水凝胶促进体内间充质干细胞（MSCs）募集：在大鼠颅骨骨缺损模型中，nG 水凝胶能有效招募 MSCs，相比 G 水凝胶和 pG 水凝胶，其周围和内部的 CD29⁺和 CD90⁺细胞增多，趋化因子 SDF - 1α 表达明显。
6. 细胞适配的 nG 水凝胶促进临界尺寸骨缺损修复：μCT 分析表明，nG 水凝胶促进骨再生效果显著，新骨覆盖面积大，骨矿物质密度（BMD）值高。组织学和免疫组化染色显示，nG 水凝胶内新骨沉积更多，成骨相关蛋白表达更强。
7. nG 水凝胶上调机械转导相关因子的表达：在体外和体内实验中，nG 水凝胶均能上调整合素 β1 和 pFAK 的表达，提示其可能通过激活整合素 / FAK 信号通路促进 MSCs 的迁移、铺展和成骨分化。

四、讨论

关键尺寸骨缺损修复困难，生物材料引导内源性干细胞分化是有前景的治疗策略。nG 水凝胶制备方法高效环保，相比传统方法优势明显。其独特微观结构，包括相互连接的纳米球形成的多孔结构、纳米结构和动态结构，分别在促进细胞增殖、迁移、吸附离子，增强细胞分化，适应细胞活动等方面发挥重要作用。nG 水凝胶通过激活整合素 β1/FAK 机械转导信号通路，至少部分地促进了成骨相关蛋白的表达，同时还影响多种细胞间的相互作用，参与复杂的骨修复过程。不过，nG 水凝胶机械性能与天然骨有差距，未来可将其与高强度材料结合，拓展临床应用。

综上所述，3D 打印的细胞适配 nG 水凝胶具有多功能成骨诱导能力，能有效促进临界尺寸骨缺损的内源性骨形成，为骨修复临床转化提供了新方向，但仍需进一步优化和研究。