miR - 22 多通路靶向治疗 MASH - HCC 的前沿突破

为解决 HCC 治疗手段有限、缺乏有效药物的问题，加州大学戴维斯分校研究人员开展 miR-22 治疗 MASH-HCC 的研究，发现其可多通路抑制肿瘤。这为 HCC 治疗带来新方向，极具科研价值，强烈推荐科研读者阅读。

　　

美国加利福尼亚大学戴维斯分校健康中心（University of California Davis Health）病理学与检验医学系的 Ying Hu、Tahereh Setayesh 等研究人员在《Cell & Bioscience》期刊上发表了题为 “Multi-pathway targeted therapy of MASH-HCC using miR-22” 的论文。这篇论文在肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）治疗领域意义重大，为攻克这一难治性疾病带来了新的曙光与希望。

研究背景

肝细胞癌是一种常见且恶性程度较高的肿瘤，目前针对它的治疗手段十分有限，缺乏能有效提高患者长期生存率的药物。临床中常采用多种药物组合的复杂鸡尾酒疗法，但这种疗法伴随着各种毒性副作用，给患者带来沉重负担。代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（Metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）是引发肝细胞癌的重要因素之一，MASH 可在基因突变和环境因素的影响下进展为 MASH-HCC。MASH-HCC 具有免疫抑制的微环境，炎症和纤维化程度较高 ，治疗难度极大。

微小 RNA-22（miR-22）此前已被发现具有代谢益处和抗癌特性，在结肠癌等疾病的治疗研究中展现出一定潜力，它能通过多种机制抑制肿瘤的增殖、发生和转移 。然而，目前对于 miR-22 在肝细胞癌治疗中的具体作用机制，以及它在肿瘤和肿瘤微环境中靶向的信号通路仍有待深入探究。开发像 miR-22 这样能选择性靶向多个癌症相关通路的单一药物，对肿瘤学的发展意义非凡，因此，开展此项研究十分必要。

研究方法

1. 动物模型构建与 miR-22 处理：研究人员选用 FVB/N 小鼠，构建了 MASH-HCC 和 HCC 小鼠模型。对于 MASH-HCC 模型，3 周龄雄性小鼠自断奶起喂食西方饮食（Western Diet，WD）或高脂饮食（High-Fat Diet，HFD）3 个月，随后通过水动力注射 Myr-AKT1、NRASV12 和睡美人转座酶诱导肿瘤发生。在肿瘤基因注射前 5 天或注射后 7 天，通过静脉注射腺相关病毒 8 型（AAV8）携带的 miR-22（5x1012 GC/kg）进行干预，同时设置 AAV8 空白对照组。
2. 纤维化定量分析：利用 ImageJ 软件对天狼星红染色的肝脏切片进行成像分析，将图像转换为 8 位灰度图，设定统一阈值，计算胶原阳性区域占总组织面积的百分比，以此量化肝脏纤维化程度。
3. RNA 提取与基因表达定量：采用 TRIzol 试剂提取总 RNA，利用高容量 RNA 逆转录试剂盒生成 cDNA，在 QuantStudio 6 Fast 实时 PCR 系统上，使用 Power SYBR Green PCR 预混液进行定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR），引物通过 Primer3 Input 软件设计。
4. 转录组分析：使用 GeoMx? 数字空间分析平台（Digital Spatial Profiler，DSP）对 4μm 的肝脏切片进行全转录组测序。切片经 RNAscope 和 GeoMx DSP RNA 检测探针染色，依据制造商协议操作。选择每组 8 个感兴趣区域（Regions of Interest，ROIs），包括 4 个肿瘤区域和 4 个边缘区域，通过 GeoMx 软件基于生物标志物分割照明区域，收集紫外线切割的 DSP 条形码用于文库制备，最后在 GeoMx DSP 平台进行空间 RNA 表达分析。
5. 生物信息数据分析：借助 GeoMx NGS（Next Gene Sequencing）流程软件将 FASTQ 测序文件转换为数字计数文件，利用 GeoMx DSP 数据分析套件进行质量控制和数据分析。数据经定量限过滤，以所有计数的第三四分位数进行归一化处理。通过线性混合效应模型（Linear Mixed Effect Model，LMM）分析和 Benjamini–Hochberg 多重校正检验确定差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs），设定 log2 转换后的倍数变化 > 0.58 或 <-0.58 且 - log10 (P)>1.3 为筛选标准。
6. 免疫细胞分析：运用单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA），根据每种细胞类型的表达偏差谱富集分数确定免疫细胞的丰度，所得富集分数经归一化处理，得到最终的免疫细胞丰度。
7. 统计分析：使用 Prism 软件 v8.2.1 进行统计分析，数据以均值 ± 标准差表示。两组间的统计学显著性差异采用双尾 Student's t 检验评估，多组间比较则采用单因素方差分析（One-way ANOVA）后进行 Tukey's t 检验，通过线性回归分析相关性，以 p<0.05 为具有统计学意义。

研究结果

1. miR-22 治疗 MASH-HCC：研究发现，miR-22 能够有效治疗 MASH-HCC。接受 miR-22 治疗的小鼠，肝脏与体重的比值降低了 50%（从 22% 降至 11%），与未患癌的 WD 喂养小鼠无显著差异。经天狼星红染色显示，miR-22 治疗显著减轻了肿瘤负担和纤维化程度，同时降低了甲胎蛋白（α-Fetoprotein，Afp）、细胞周期蛋白 A2（Cyclin A2，Ccna2）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖 - 3（Glypican-3，Gpc3）和半乳糖凝集素 - 1（Galectin-1，Lgals1）等 mRNA 的表达水平。
2. miR-22 在 MASH-HCC 中改变免疫谱的空间效应：通过转录组数据研究发现，MASH-HCC 肿瘤内存在大量免疫细胞，如树突状细胞、T 细胞、B 细胞和浆细胞等，且肿瘤内的浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）、单核细胞来源的树突状细胞（monocyte-derived dendritic cells，moDCs）、常规树突状细胞（conventional dendritic cells，cDC1 和 cDC2）以及自然杀伤 T 细胞（Natural killer T，NKT）、γδ T 细胞（Tgd）、初始 CD8? T 细胞、记忆 CD4? T 细胞（CD4 Tm）和调节性 T 细胞（Regulatory T cells，Tregs）等数量较多。而单核细胞、M1 和 M2 巨噬细胞在肿瘤边缘和非肿瘤区域更为普遍。miR-22 治疗后，肿瘤内中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞数量增加，T 细胞和 B 细胞数量减少，同时 M1 和 M2 巨噬细胞增多，树突状细胞减少，初始 CD8? T 细胞、记忆 CD4? T 细胞、记忆 B 细胞和浆细胞数量也降低。在肿瘤边缘，miR-22 治疗使 M1 巨噬细胞增多，B 细胞和浆细胞减少，非肿瘤区域免疫细胞谱则无显著变化。总体而言，miR-22 治疗后的小鼠免疫谱与健康肝脏相似。
3. miR-22 在 HCC 和 MASH-HCC 中改变信号通路的空间效应：在肿瘤内部，miR-22 治疗对 MASH-HCC 的转录组和信号通路影响比 HCC 更为显著。miR-22 上调了 MASH-HCC 肿瘤内的内源性代谢（包括胆汁酸和脂质代谢）和外源性解毒相关通路，增强了免疫系统和细胞间相互作用，同时下调了纤维化相关通路，如细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）组织、整合素细胞表面相互作用、胶原蛋白形成和降解、胶原纤维交联和弹性纤维形成等，还抑制了酪氨酸激酶受体、MET、转化生长因子 β（TGFβ）和胰岛素样生长因子（IGF）等信号通路。在肿瘤边缘，miR-22 对代谢的调节作用在 HCC 和 MASH-HCC 中有所不同，在 HCC 中改善代谢，在 MASH-HCC 中则抑制代谢，但在两种模型中均抑制生长信号。在非肿瘤区域，miR-22 在 HCC 和 MASH-HCC 中的作用也存在差异，在 HCC 中主要下调免疫和炎症信号，在 MASH-HCC 中则下调代谢、电子传递和线粒体功能。
4. miR-22 预防肝癌发生：研究人员进一步测试了在肿瘤基因注射前 5 天给予 miR-22 的抗癌效果。结果显示，早期 miR-22 治疗降低了肝脏 / 体重和脾脏 / 体重比值，减少了纤维化，降低了 Afp、Ccna2、Gpc3 和 Lgals1 的表达，延长了小鼠的生存时间，对照组小鼠中位生存期为 42 天，而 miR-22 治疗组为 58 天。
5. 早期与晚期给予 miR-22 在 HCC 中的时空效应：通过转录组学数据对比发现，早期和晚期给予 miR-22 在肿瘤内影响的信号通路不同。早期治疗上调了抗原加工、免疫和吞噬作用相关通路，晚期治疗则改善了胆固醇和类固醇代谢，下调了 GTPase 循环和造血作用相关通路，且两个时间点均降低了肿瘤内的糖酵解、葡萄糖代谢、细胞反应、血液凝固和激活素拮抗作用。在肿瘤边缘，早期治疗上调了 DNA 修复、核苷酸切除修复等通路，抑制了轴突导向、神经系统发育等信号通路；晚期治疗上调了脂质代谢和 ABC 家族转运通路，下调了 Rho GTPase、死亡受体和血小板衍生生长因子（PDGF）信号通路。在非肿瘤区域，早期治疗上调了代谢、RNA 加工等通路，减少了细胞凋亡、自噬等；晚期治疗主要影响了 VEGFA-VEGFR2 通路等少数通路。两种治疗均上调了细胞对刺激的反应，表明细胞功能趋于正常化。
6. 早期 miR-22 干预治疗 WD-MASH-HCC 和 HFD-MASH-HCC：在 WD 或 HFD 诱导的 MASH-HCC 模型中，早期给予 miR-22 干预均有效降低了肿瘤负荷，减少了肝脏与体重的比值和纤维化程度，且 WD-MASH-HCC 的纤维化程度比 HFD-MASH-HCC 更严重。

研究结论与讨论

本研究充分表明，miR-22 基因疗法在治疗 HCC 方面极具潜力。在多种小鼠 HCC 模型中，不同时间给予 miR-22 均展现出显著的抗癌效果。它能够有效减轻肿瘤负担、减少纤维化、抑制肿瘤生长信号、调节免疫微环境、改善肿瘤内代谢以及抑制肿瘤发生相关的信号通路，如 Rho GTPase 信号通路等。此外，miR-22 过表达在 HCC 小鼠中未产生明显毒性，为 HCC 治疗提供了一种更有效且低毒的选择，有望改变当前 HCC 的治疗模式。

miR-22 在减少纤维化方面效果显著，并且具有预防 HCC 发生的作用。虽然基因疗法用于癌症预防在现阶段可能不太可行，但未来可探索将 miR-22 包装在不同的递送系统中，用于治疗晚期纤维化患者。在免疫调节方面，miR-22 能促进肿瘤内先天免疫细胞的扩增，减少适应性免疫细胞的数量，使 MASH-HCC 肿瘤中过度的抗原呈递和促炎环境趋于正常化，但其具体机制仍有待进一步深入研究。

miR-22 对肿瘤代谢的调节作用十分复杂，在肿瘤边缘和非肿瘤组织中，它降低了多种代谢途径，这可能是对肿瘤微环境改变的一种适应性反应，同时也表明 miR-22 在脂肪性肝病中具有代谢沉默和肿瘤抑制的双重作用。肿瘤发生的微环境对癌症发展至关重要，miR-22 通过抑制 Rho GTPase 信号通路，在抑制肿瘤微环境形成方面发挥了关键作用。

然而，本研究也存在一定的局限性。目前使用的 AAV8 递送系统进入免疫细胞的效率有限，未来应测试 AAV2 和 AAV6 等其他递送载体对 miR-22 的递送效果。此外，miR-22 在特定细胞类型中靶向的基因和通路，以及它在免疫细胞和癌细胞中调节代谢的具体机制，还有待进一步探索。

总的来说，miR-22 作为一种能靶向多个癌症相关通路的 “潜力药物”，为 HCC 的治疗开辟了新的方向，后续研究若能解决现有问题，有望为 HCC 患者带来新的希望，推动肿瘤治疗领域的重大进步。