网络药理学联合体内实验揭秘朱芍颗粒抗溃疡性结肠炎全新机制

为解决溃疡性结肠炎（UC）治疗难题及朱芍颗粒（ZSG）机制不明问题，青岛大学附属烟台毓璜顶医院研究人员开展 ZSG 抗 UC 机制研究。结果发现 ZSG 可抑制 ZBP1/RIP/NF-κB 通路改善症状。该研究为 UC 治疗和 ZSG 应用提供新方向，值得一读。

　　

青岛大学附属烟台毓璜顶医院中心实验室（Central Laboratory, Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University）的研究人员在《Biological Procedures Online》期刊上发表了题为 “Network pharmacology and experimental verification in vivo reveal the mechanism of Zhushao Granules against ulcerative colitis” 的论文。这篇论文在溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）的治疗研究领域具有重要意义，为探索中药治疗 UC 的机制提供了新的方向和思路，也为 UC 的临床治疗和药物研发带来了新的希望。

研究背景

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性、免疫介导的非特异性炎症性疾病，主要影响直肠和结肠的黏膜炎症。它的症状包括出血性腹泻、黏液或脓液排出，还会在排便时引起腹部绞痛。UC 病程漫长，容易因炎症细胞浸润而反复发作，这大大增加了患结肠炎相关癌症（Colitis-Associated Cancer，CAC）的风险，世界卫生组织（WHO）已将其列为现代难治性疾病。目前，UC 的发病机制与遗传异常、饮食因素、肠道屏障功能障碍、肠道菌群失衡以及免疫失调等多种因素有关。临床治疗方法虽然多样，包括使用柳氮磺胺吡啶（Salicylazosulfapyridine，SASP）、美沙拉嗪、硫唑嘌呤、泼尼松、甲氨蝶呤、Janus 激酶阻滞剂和干细胞疗法等，但这些治疗方法都存在一定的局限性，只能缓解症状，无法彻底治愈疾病，且停药后易复发，长期用药还会产生一系列副作用。因此，寻找更安全、有效的 UC 治疗方案迫在眉睫。

中药是一个丰富的药物资源宝库，其多成分、多靶点、多通道的特点，在长期临床应用中，能通过活性成分的协同作用增强身体功能、降低药物毒性。朱芍颗粒（Zhushao Granules，ZSG）源自中医古方 “痛泻要方”（Tongxieyaofang，TXYF）的加减，在临床上已用于治疗 UC 患者。它由十五味中药组成，具有健脾和胃（如白术 Atractylodes macrocephala Koidz. 、黄芪 Astragalus mongholicus Bunge 等）、止痛（如白芍 Paeonia lactiflora Pall. 、防风 Saposhnikovia divaricata 等）、止泻（如补骨脂 Cullen corylifolium 、诃子 Terminalia chebula Retz. 等）以及调节胃肠动力（如陈皮 Cttri reticulatae Pericarpium 、乌药 LinderaeRadix 等）的功效。然而，由于 ZSG 成分复杂、靶点众多，其药理机制尚不明确，这严重限制了它在临床上的广泛应用。

网络药理学（Network Pharmacology）作为一种基于多向系统药理学和生物学的现代理论，近年来在中药研究中得到了广泛应用。它强调中药的多成分、多靶点、多通道特性，能够更系统、全面地揭示中药方剂的科学依据和治疗机制。鉴于 UC 是一种多因素自身免疫性疾病，免疫调节在其发病过程中起着关键作用，而 Z-DNA 结合蛋白 1（Z-DNA binding protein 1，ZBP1）在细胞死亡、炎症和免疫中具有重要调节作用，且 ZSG 可能通过 ZBP1/RIP/NF-κB 通路发挥治疗 UC 的作用，但目前对 ZSG 治疗 UC 的具体机制仍缺乏系统研究。因此，开展这项研究具有重要的必要性和紧迫性。

研究方法

1. 筛选 ZSG 的活性成分：从《中医百科全书》（Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）中收集 ZSG 的 13 种草药活性成分，并根据类药权重（Drug-likeness Weight，DW）≥0.49 进行筛选，对于诃子（HZ）和乌药（WY），则利用中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），通过口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30% 和类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18 来补充确定其活性成分。
2. 预测 ZSG 和 UC 的潜在靶点：通过 ETCM 数据库匹配中药成分的预测靶基因，获取 ZSG 的潜在靶点（score≥0.8），HZ 和 WY 的相关靶点从 TCMSP 补充获取。从 OMIM 数据库查询 UC 的相关靶点，从 HINT 数据库提取相互作用蛋白，将 ZSG 和 UC 的重叠靶点确定为 ZSG 治疗 UC 的潜在靶点，并绘制维恩图（Venn diagram）。
3. 构建蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络：从 STRING 数据库导出治疗靶点之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用数据（物种限定为 “智人”，置信度评分 0.4），利用 Cytoscape 3.6.1 软件进行网络可视化和分析。
4. 基因本体（GO）和通路分析：使用注释、可视化和综合发现数据库（Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery，DAVID）对治疗靶点进行 GO 分析（包括生物过程 Biological Process，BP 和分子功能 Molecular Function，MF）和 Reactome 通路分析，物种设置为 “智人”，显著富集阈值设为 P<0.001 。
5. 构建 “草药 - 成分 - 靶点 - 通路” 网络：基于 ZSG 治疗 UC 的潜在靶点，追溯相应的活性成分和草药，利用 Cytoscape 3.6.1 软件构建 “草药 - 成分 - 靶点 - 通路” 网络，使用 “NetworkAnalyzer” 插件计算网络拓扑参数，识别与抗 UC 活性相关的核心活性成分、靶点和通路。
6. 动物实验验证：购买 BALB/c 小鼠，适应性饲养 7 天后，随机分为 6 组：对照组、TNBS 模型组、ZSG 低剂量组（1.56 g/kg）、ZSG 中剂量组（3.12 g/kg）、ZSG 高剂量组（6.24 g/kg）和 SASP 组（390 mg/kg）。通过 TNBS/50% 乙醇稀释灌肠诱导小鼠慢性 UC 模型，持续 6 周。ZSG 组和 SASP 组小鼠给药 21 天，对照组和模型组给予无菌水灌肠。实验过程中，通过疾病活动指数（Disease Activity Index，DAI）评估小鼠健康状况，对结肠组织进行组织学损伤评估，并通过蛋白质免疫印迹法（Western blot analysis）检测 ZBP1/RIP/NF-κB 通路相关蛋白的表达。
7. 统计分析：使用 GraphPad Prism 6.0 软件处理数据，数据以平均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，采用单因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA）和未配对双尾 t 检验评估组间差异的显著性，P<0.05 表示差异具有统计学意义。

研究结果

1. ZSG 的活性成分：从 ETCM 和 TCMSP 数据库中筛选出 ZSG 的 94 种活性成分，这些成分来自不同的草药，如白术中有 6 种、白芍中有 5 种等，去除重复成分后得到最终结果。
2. ZSG 治疗 UC 的潜在靶点：通过多个数据库预测和筛选，共得到 ZSG 的 460 个潜在靶点，UC 的 884 个潜在靶点，两者重叠得到 62 个 ZSG 治疗 UC 的潜在靶点。在这些靶点中，TP53 是最关键的靶点，其次是 HSP90AA1、ESR1、HIF1A 和 CCND1 等。
3. GO 和通路分析结果：GO 富集分析结果显示，在生物过程方面，ZSG 对 DNA 模板转录的正调控、RNA 聚合酶 II 启动子转录的正调控等有显著影响；在分子功能方面，主要涉及酶结合、蛋白激酶结合等。Reactome 通路富集分析表明，ZSG 通过多种通路发挥治疗 UC 的作用，其中前 10 条显著富集的通路主要涉及信号转导、免疫系统中的细胞因子信号传导等。
4. “草药 - 成分 - 靶点 - 通路” 网络构建：构建的网络包含 219 个节点（12 种草药、48 种成分、61 个靶点和 98 条通路）和 1374 条边，呈现出中药多化合物、多靶点、多通路的特点。通过计算网络拓扑参数，确定了核心活性成分（如槲皮素 quercetin、儿茶素 Catechin 等）、核心靶点（如 ESR1、AR 等）和核心通路（如信号转导、疾病相关通路等）。
5. UC 小鼠模型的建立及评估：成功建立 TNBS 诱导的 BALB/c 小鼠 UC 模型，模型组小鼠 DAI 评分显著高于对照组，表明模型建立成功。给予 ZSG 和 SASP 治疗后，高剂量 ZSG 组和 SASP 组小鼠的 DAI 评分显著降低，表明症状得到改善。组织学损伤评估显示，模型组小鼠结肠组织出现广泛的黏膜损伤、炎症浸润等，而 ZSG 和 SASP 治疗组小鼠的肠道黏膜完整性得到恢复，隐窝结构保存较好，ZSG 高剂量组的改善效果最为明显。
6. ZSG 对 ZBP1/RIP/NF-κB 通路的影响：Western blot 分析结果表明，TNBS 诱导组中 ZBP1/RIP/NF-κB 通路显著激活，RIP3 和 p-p65 表达增加，p65 表达降低。ZSG 高剂量组和 SASP 组中 ZBP1 表达显著上调，ZSG 中高剂量组 RIP3 表达显著抑制，ZSG 中剂量组 p65 表达显著促进，ZSG 中高剂量组和 SASP 组 p-p65 磷酸化明显抑制。这些结果表明，ZSG 可能通过靶向 ZBP1/RIP/NF-κB 通路缓解小鼠 UC 症状。

研究结论与讨论

本研究通过网络药理学和动物实验相结合的方法，系统地探究了 ZSG 治疗 UC 的活性成分、潜在靶点和作用机制。研究发现，ZSG 含有 94 种活性成分，作用于 460 个潜在靶点，其中 62 个与 UC 相关的靶点为治疗靶点。这些靶点主要参与免疫调节，尤其是 RIP 介导的通过 ZBP1 激活 NF-κB 的通路，这在 ZSG 治疗 UC 的过程中可能起着至关重要的作用。

实验还确定了 9 种核心活性成分，如槲皮素、儿茶素等，它们在多种中药中广泛存在，且已有研究表明它们对 UC 具有一定的保护作用。同时，确定了 20 个核心靶点，其中部分靶点参与了 ZBP1/RIP/NF-κB 通路，进一步证实了该通路的重要性。动物实验结果显示，ZSG 能够显著改善 TNBS 诱导的小鼠 UC 症状，减轻结肠组织的病理损伤，其作用机制可能是通过抑制 ZBP1/RIP/NF-κB 通路来实现的。

此外，研究还发现 ZSG 中剂量组在抑制炎症方面效果显著，高剂量组在各项评估指标上均有综合改善，呈现出剂量依赖性疗效。与传统治疗 UC 的药物 SASP 相比，ZSG 在高剂量时疗效相当甚至略好，且 SASP 可能会引起厌食、头痛、恶心等多种不良反应，而 ZSG 有望避免这些问题，成为 UC 治疗的替代疗法。

然而，本研究也存在一定的局限性。实验样本量较小且缺乏多次重复，这限制了研究结果的普遍性。未来的研究需要进一步扩大样本量，进行更多的实验来验证 ZSG 对 UC 的治疗效果。同时，还需要深入研究核心活性成分的具体作用机制，明确它们之间的协同作用关系，以及探究这些核心靶点与 UC 之间更深入的关联，通过基因敲低或敲除模型等方法进一步完善相关信号通路的研究。

总的来说，这项研究为 ZSG 的临床应用和进一步研发提供了坚实的理论基础，揭示了 ZSG 通过 ZBP1/RIP/NF-κB 通路治疗 UC 的机制，为 UC 的治疗开辟了新的视角，也为中药复方治疗复杂疾病的研究提供了有益的参考，有望推动中药在 UC 治疗领域的发展，为广大 UC 患者带来新的希望。