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为探究 TL 与高血压患者死亡率的关系，新疆医科大学第一附属医院的研究人员开展相关研究。结果显示 DNAmTL 预测长期全因死亡率更优。该研究为高血压患者死亡风险评估提供新视角，值得科研读者一读。
新疆医科大学第一附属医院（Department of Cardiac Pacing and Electrophysiology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University）的研究人员 Qianhui Wang 等人在《Clinical Epigenetics》期刊上发表了题为 “DNA methylation?based telomere length is more strongly associated with long?term all?cause mortality than quantitative polymerase chain reaction?based telomere length among middle?aged and older hypertensive adults” 的论文。这篇论文在心血管疾病与衰老相关研究领域具有重要意义，为深入了解高血压患者的死亡风险预测以及探索新的干预靶点提供了关键依据 。
一、研究背景
端粒（Telomeres）是位于染色体末端的特殊结构，由重复的 TTAGGG 序列和相关蛋白质组成，它在维持基因组完整性方面发挥着关键作用。随着细胞不断分裂，端粒会逐渐缩短，这一过程被视为细胞衰老的标志 。正因如此，端粒越来越被看作是衰老以及心血管疾病（CVD）、癌症、糖尿病等相关疾病的重要生物标志物。
高血压，以血压（BP）持续升高为特征，是导致死亡率上升的一个重要风险因素，它还会促使中风、心力衰竭（HF）和冠心病（CHD）等严重疾病的发生。以往研究已经证实，较短的端粒长度（TL）与高血压发病风险增加之间存在显著关联。
在过去几十年里，多种测量端粒长度的方法相继问世，像 Southern blot 端粒限制片段（TRF）分析、荧光原位杂交（flow FISH）和定量聚合酶链反应（qPCR）等。其中，Southern blot 和 flow FISH 虽被视为金标准，但它们对 DNA 质量和数量要求较高，操作需要专业技能，成本也不低。目前，qPCR 因高效且对 DNA 需求量少而应用最为广泛。近年来，一种利用胞嘧啶 - 磷酸 - 鸟嘌呤二核苷酸（CpGs）中胞嘧啶残基的甲基化模式来估算端粒长度（DNAmTL）的新方法崭露头角，研究发现它与年龄和死亡率的关联比基于 qPCR 的端粒长度测量方法（qPCRTL）更为紧密。
此前，Fyhrquist 等人观察到，在患有左心室肥大（LVH）的高血压成年人中，用 Southern blot 测量的短端粒与年龄仅存在微弱相关性，与死亡率的关联也不显著，尽管其与心血管疾病风险存在明显联系。基于上述情况，本研究旨在深入探究：（1）通过 qPCR 和 DNA 甲基化（DNAm）估算的端粒长度与中老年高血压成年人长期死亡率之间的关系；（2）比较 DNAmTL 和 qPCRTL 对长期死亡率的预测价值。
二、研究方法
- 研究设计和人群：该队列研究借助了 1999 - 2000 年和 2001 - 2002 年美国国家健康与营养检查调查（NHANES）的数据。NHANES 是一项全国性项目，采用多阶段复杂抽样设计，用于评估美国成年人和儿童的健康及营养状况。研究方案经美国国家卫生统计中心（NCHS）研究伦理审查委员会批准，所有参与者均签署了书面知情同意书。研究排除了那些 DNAmTL 或 qPCRTL 数据缺失、未患高血压或无随访信息的参与者。高血压的定义为自我报告经医生诊断、正在使用降压药物，或收缩压（SBP）≥140 mmHg 、舒张压（DBP）≥90 mmHg。心血管疾病（CVD）则依据自我报告的心力衰竭、冠心病、心绞痛、心肌梗死或中风等诊断来确定。
- DNAmTL 测量：DNA 甲基化分析在杜克大学 Yongmei Liu 博士的实验室进行。使用 Zymo EZ DNA 甲基化试剂盒，按照制造商的说明，对 500 ng DNA 进行亚硫酸氢盐转化。随后，将转化后的 DNA 在针对 Illumina Infinium 甲基化检测优化的 PCR 条件下进行处理。利用 Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip 生成甲基化图谱。经亚硫酸氢盐处理的 DNA 与 BeadChip 杂交，杂交后样本依次进行变性、扩增、片段化、沉淀和重悬，接着再进行一轮杂交。之后，对 BeadChip 进行洗涤、标记用于引物延伸，最后使用 Illumina iScan 系统进行扫描。基于 DNA 甲基化数据，通过弹性网络回归模型计算出 DNAmTL。
- qPCRTL 测量：qPCRTL 测量在加州大学旧金山分校 Elizabeth Blackburn 博士的实验室开展。端粒长度以标准参考 DNA 进行标准化，并表示为 T/S 比值。每个样本在不同日期进行三次重复分析，每个样本最终得到六个数据点。检测板分批处理，每块板都设有对照孔。若检测板上无效对照孔达到八个或更多，则该检测数据被排除在分析之外，这种情况影响不到 1% 的检测运行。利用对照 DNA 的校准值控制批间差异，若对照 DNA 值偏离平均值超过 2.5 个标准差，该批次检测数据也会被排除，受此影响的检测运行不到 6%。此外，还会排除占样本量不到 2% 的异常值。最后计算 T/S 比值的平均值和标准差，批间变异系数为 6.5%。
- 死亡率确定：通过将 NHANES 记录与截至 2019 年 12 月 31 日的美国国家死亡索引（NDI）进行关联，获取死亡率数据。依据国际疾病分类第 10 版（ICD - 10）对死亡原因进行分类。
- 统计分析：考虑到 NHANES 复杂的抽样设计，在统计分析时应用了抽样权重。根据参与者的 DNAmTL 和 qPCRTL 水平将其分为四分位数组。连续变量以均值 ± 标准差（SD）或中位数（四分位数间距）表示，根据数据分布情况，分别采用加权 t 检验或 Wilcoxon 秩和检验进行分析。分类变量以频率（百分比）报告，并使用加权卡方检验进行分析。采用 Pearson 相关性分析研究 DNAmTL、qPCRTL 和年龄之间的关系。
使用 Kaplan - Meier 曲线比较不同 DNAmTL 和 qPCRTL 四分位数组的死亡率。运用三个加权 Cox 比例风险模型评估端粒长度与死亡风险之间的关联：模型 I 仅调整年龄和性别；模型 II 进一步调整吸烟状况、饮酒量、受教育程度、贫困收入比（PIR）和体重指数（BMI）；模型 III 则在模型 II 的基础上，额外调整心血管疾病、糖尿病、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、尿酸（UA）和估算肾小球滤过率（eGFR）。采用限制立方样条（RCS）曲线评估 DNAmTL、qPCRTL 与死亡风险之间潜在的非线性剂量 - 反应关系。利用受试者工作特征（ROC）曲线评估 DNAmTL 和 qPCRTL 对死亡率的预测性能，并通过 DeLong 检验比较曲线下面积（AUC）。此外，还进行了亚组分析和敏感性分析，以检验不同人群中端粒长度与死亡率之间关联的稳健性。所有统计分析均使用 R 软件（4.0.3 版本）完成，设定双侧 P 值 < 0.05 为具有统计学意义。
三、研究结果
- 参与者的基线特征：本研究共纳入 1601 名参与者，平均年龄为 68.02±9.85 岁，其中男性 761 人（47.53%）。在中位随访期 184 个月内，有 988 名参与者死亡，其中 279 人死于心血管疾病。与幸存者相比，死亡者通常年龄更大、男性比例更高、以白人为主、吸烟率更高，受教育程度更低，总胆固醇（TC）和估算肾小球滤过率（eGFR）水平更低，但尿酸（UA）水平更高，糖尿病和心血管疾病的患病率也更高。死亡者的 DNAmTL（6.45±0.30 vs. 6.70±0.28，P<0.001）和 qPCRTL（0.89±0.22 vs. 0.99±0.24，P<0.001）显著短于幸存者 。而且，DNAmTL 与年龄的相关性比 qPCRTL 更强（r=-0.59 vs r=-0.27）。
- 高血压成年人中端粒长度与死亡率的关联：加权 Cox 回归模型分析显示，较短的端粒长度与全因死亡风险增加显著相关。具体而言，DNAmTL 每减少 1kb，全因死亡风险降低 52%（风险比（HR）0.48，95% 置信区间（CI）0.32 - 0.74，P=0.001）；qPCRTL 每减少 1kb，全因死亡风险降低 38%（HR 0.62，95% CI 0.39 - 0.99，P=0.047）。DNAmTL 和 qPCRTL 处于最高四分位数（Q4）的参与者，与处于最低四分位数（Q1）的参与者相比，全因死亡风险分别降低 36%（HR 0.64，95% CI 0.45 - 0.91，P=0.013）和 25%（HR 0.75，95% CI 0.58 - 0.97，P=0.031）。Kaplan - Meier 曲线表明，随着 DNAmTL 和 qPCRTL 的增加，死亡率显著升高。不过，研究未发现端粒长度与心血管疾病死亡率之间存在显著关联。限制立方样条（RCS）曲线显示，在高血压成年人中，DNAmTL（非线性 P 值：0.422）和 qPCRTL（非线性 P 值：0.841）与全因死亡风险之间呈线性剂量 - 反应关系。
- 预测价值比较：受试者工作特征（ROC）曲线分析结果显示，DNAmTL 对长期全因死亡率的预测价值优于 qPCRTL（曲线下面积（AUC）分别为 0.73 和 0.63，P<0.001 ）。
- 亚组和敏感性分析：亚组分析按照年龄、性别、吸烟状况、饮酒量、肥胖（BMI≥30 kg/m2）以及是否患有心血管疾病和糖尿病进行分层，结果显示端粒长度对死亡率的影响在各个亚组中均保持一致（所有交互作用 P 值 > 0.05）。敏感性分析排除了随访前两年内死亡的参与者，进一步证实了在高血压成年人中，DNAmTL 和 qPCRTL 与全因死亡率之间存在稳定的关联 。
四、研究结论与讨论
在这项针对中老年高血压成年人的研究中，研究人员发现：（1）死亡参与者的 DNAmTL 和 qPCRTL 均显著短于幸存者；（2）较短的端粒长度与全因死亡风险增加相关；（3）与 qPCRTL 相比，DNAmTL 与年龄的相关性更强，对全因死亡率的预测价值也更高。
众多研究表明，端粒长度与全因死亡率之间存在显著的负相关关系，但此前研究大多采用 Southern blot 等传统测量方法。本研究采用 qPCR 和 DNA 甲基化方法，发现 DNAmTL 在预测全因死亡率方面表现更优。亚组分析中，在不同年龄组中，DNAmTL 与全因死亡率均存在显著关联，而 qPCRTL 仅在 65 岁及以上成年人中与全因死亡率相关，这与以往研究认为 qPCRTL 在年轻人群中敏感性较低的观点相符，提示 qPCRTL 对死亡风险的预测价值可能随年龄增长而更加明显。
关于端粒长度与心血管疾病死亡率的关系，目前尚无定论。本研究首次证实，在中老年高血压成年人中，DNAmTL 与心血管疾病死亡率无显著相关性，这与部分既往研究结果一致。端粒长度与心血管疾病死亡率之间缺乏明显关联，可能是由于研究人群的高血压特性影响了两者关系，或者是心血管疾病死亡率涵盖多种疾病，不同疾病对端粒长度的影响存在差异。
这项研究也存在一些局限性。由于其为观察性研究，无法确定端粒长度与死亡率之间的因果关系。研究队列仅包含美国参与者，结论在更广泛人群中的适用性有待进一步研究。此外，虽然研究调整了多种潜在混杂因素，但可能仍存在未考虑到的变量，如环境因素等，这些因素可能会对研究结果产生影响。尽管如此，本研究依然为高血压患者的死亡风险预测提供了新的视角，强调了 DNAmTL 在评估长期全因死亡率方面的优势，有助于未来进一步探索针对高血压患者的精准健康管理策略，为心血管疾病的预防和治疗开辟新的方向 。
