blaOXA-232质粒介导的肺炎克雷伯菌群体异质性研究：碳青霉烯耐药性、毒力与适应度的动态演变

本研究针对肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)获得blaOXA-232质粒后产生的群体异质性展开深入探索。研究人员通过电转化技术将携带blaOXA-232的ColE型质粒导入碳青霉烯敏感菌株，发现高耐药(HCR)和低耐药(LCR)亚群的分化现象。研究揭示ompK36基因缺陷是导致HCR亚群高耐药性的关键因素，同时发现9,000 bp基因组缺失的补偿性突变可稳定耐药表型。该成果发表于《Journal of Biomedical Science》，为临床监测细菌群体动态演变提供重要依据。

　　

碳青霉烯类抗生素作为治疗多重耐药革兰阴性菌感染的最后防线，其耐药性问题日益严峻。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)作为医院获得性感染的重要病原体，通过产生碳青霉烯酶(如OXA-48型)等机制对这类抗生素产生耐药性。更令人担忧的是，细菌群体中存在的异质性现象使得标准药敏检测可能漏检耐药亚群，导致治疗失败和感染复发。这种"隐形"的耐药性进化机制已成为临床抗感染治疗的重大挑战。

为探究质粒介导的碳青霉烯耐药性动态演变过程，韩国首尔大学(Seoul National University)的Yun Young Cho、Sun Ju Kim和Kwan Soo Ko研究团队开展了一项创新性研究。研究人员选择两株碳青霉烯敏感的ST11型肺炎克雷伯菌临床分离株(KCS20和KCS22)，通过电转化技术引入临床来源的bla_OXA-232质粒，成功构建了具有群体异质性的转化子模型。该研究采用时间杀菌实验、群体分析图谱(PAP)、竞争指数测定等技术，结合全基因组测序和qRT-PCR分析，系统阐明了耐药性异质性的形成机制及其临床意义。

关键技术方法包括：1) 从临床菌株提取bla_OXA-232质粒并通过电转化构建等基因转化子；2) 采用贴片培养法分离HCR和LCR亚群；3) 通过20天无抗生素传代实验评估表型稳定性；4) 全基因组测序(Nanopore和Illumina双平台)鉴定基因突变；5) qRT-PCR分析耐药和毒力基因表达差异。

Identification and isolation of two subpopulations

研究发现bla_OXA-232质粒导入后，转化子立即表现出显著的异质性。时间杀菌实验显示，在8 mg/L亚胺培南压力下，培养3小时后即可观察到明显的群体分化。通过贴片培养法成功分离出高耐药(HCR，MIC>64 mg/L)和低耐药(LCR，MIC=4 mg/L)亚群，证实了异质性的客观存在。

Variation in carbapenem resistance between subpopulations of transformants and expression of blaOXA-232

耐药性差异与bla_OXA-232表达水平无关，qRT-PCR显示HCR和LCR亚群的bla_OXA-232转录水平相当。这一发现提示存在其他机制主导高耐药表型的形成。

Growth, fitness, and phenotype stability

HCR亚群表现出明显的生长劣势，在无抗生素竞争中显著弱于LCR亚群。但值得注意的是，经过20天无抗生素传代后，HCR亚群并未完全消失，而是形成了新的异质性群体(H-Hr)，其中包含约10^-6比例的HCR亚群。从这些群体中分离的稳定HCR亚群(KCS20T/H-Hr/H)恢复了野生型的生长速率。

Variations in virulence between subpopulations of transformants

HCR亚群表现出更强的血清抗性和毒力基因(fimH、traT和soxS)上调。尽管在蜡螟感染模型中HCR与LCR亚群的致死率无统计学差异，但两者均显著高于野生型菌株，表明质粒获得本身增强了毒力。

Genomic comparison

全基因组测序揭示了ompK36基因的关键作用：KCS20T/H存在259 bp缺失(Glu54_Asp314del)，KCS22T/H则出现移码突变，均导致孔蛋白功能丧失。在稳定HCR亚群中还发现9,000 bp补偿性缺失区域，包含dcm、vsr等基因，可能通过表观遗传调控恢复适应度。

Genetic alterations in heterogeneous strains

二次异质性菌株(KCS20T/H-Hr)中检测到IS_Kpn14转座酶插入，提示转座元件可能参与基因组重塑过程。这些遗传改变共同构成了从暂时性异质性到稳定高耐药的进化路径。

该研究首次系统揭示了肺炎克雷伯菌在获得低水平耐药质粒后，通过ompK36缺陷和补偿性突变的协同作用，逐步发展为稳定高耐药表型的动态过程。这一发现对临床实践具有多重启示：首先，标准药敏检测可能低估bla_OXA-232等"低风险"碳青霉烯酶的临床威胁；其次，ompK36功能状态应作为预测耐药性进化风险的重要指标；最后，异质性群体的动态演变提示需要开发新的检测方法以识别"隐形"耐药亚群。研究提出的"异质性-补偿突变-稳定耐药"进化模型，为理解细菌耐药性发展提供了新的理论框架，对指导临床用药和防控耐药菌传播具有重要意义。