新型 pH/ROS 双响应纳米颗粒靶向治疗胃癌的突破性研究

为解决 DTX 治疗胃癌时存在的副作用大、溶解度低等问题，陆军军医大学研究人员开展了 DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 治疗胃癌的研究。结果显示其能有效抑制肿瘤生长。推荐科研读者阅读，共同探索胃癌治疗新方向。

　　

陆军军医大学（第三军医大学）西南医院普通外科以及陆军军医大学基础医学院化学系的研究人员 Junjia Wu、Kun Du 等人，在《Cancer Nanotechnology》期刊上发表了题为 “Docetaxel?loaded pH/ROS dual?responsive nanoparticles for the targeted treatment of gastric cancer” 的论文。这篇论文在胃癌治疗领域具有重要意义，为攻克胃癌这一严重威胁人类健康的难题提供了新的思路和方法。

一、研究背景

胃癌（Gastric Cancer，GC）是全球范围内严重威胁公众健康的重大疾病。据国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）2022 年的调查数据显示，胃癌是全球第五大常见恶性肿瘤，死亡率极高。在东亚地区，如韩国、日本和中国，胃癌的发病率尤其突出。由于胃癌早期临床症状不明显，且胃镜检查的普及程度有限，许多患者确诊时已处于晚期。尽管目前针对胃癌有多种先进治疗手段，但患者的整体长期生存率依旧较低。

目前，手术联合化疗是胃癌治疗的重要方式。多西他赛（Docetaxel，DTX）作为一种广谱抗肿瘤药物，在胃癌化疗中应用广泛。它能够阻断细胞周期在 G2/M 期，抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡。然而，DTX 在临床应用中存在诸多限制，比如水溶性差，这使得它在体内的分散和运输困难；同时，它还具有非特异性分布、快速降解以及明显的副作用等问题，严重影响了其治疗效果和患者的生活质量。

纳米药物递送系统（Nano-drug delivery systems，NDDSs）的出现为解决这些问题带来了希望。NDDSs 具有增强药物溶解性、延长药物在体内的循环时间、改善药物生物相容性以及降低药物毒性等优势。通过 NDDSs 实现化疗药物的靶向递送，在胃癌治疗研究中备受关注。已有研究表明，像紫杉醇（Paclitaxel）、5 - 氟尿嘧啶（5-Fluorouracil）和顺铂（Cisplatin）等纳米疗法，在治疗胃癌方面展现出显著的抗肿瘤效果，同时降低了全身毒性。DTX 负载的纳米颗粒（Nanoparticles，NPs）也已用于胃癌治疗的探索，但仍有提升空间。

此外，胃癌细胞具有高活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平和酸性微环境的特点，肿瘤细胞表面还过度表达多种受体，如叶酸受体（Folate Receptors，FR）等。利用这些特性，开发 pH/ROS 双响应且能靶向肿瘤细胞的纳米治疗剂成为研究热点。研究团队前期制备了 pH/ROS 双响应材料 CA-Oxi-αCD，并以此为载体构建了 DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 用于乳腺癌治疗，取得了良好效果。基于此，研究人员进一步探究该纳米颗粒对胃癌的治疗效果。

二、研究方法

1. 材料制备：DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 的制备采用前期研究的方法。将卵磷脂、DSPE-PEG2000 等分散于含乙醇的去离子水中加热，再将 CA-Oxi-αCD、DTX 溶解后缓慢滴加到脂质分散液中，室温自组装，离心收集纳米颗粒。制备 FA 修饰的纳米颗粒时，使用 FA-DSPE-PEG3400 。同时，制备了 Cy5 标记的相关纳米颗粒用于后续实验。
2. 细胞和动物实验：实验使用人胃癌细胞系 HGC-27 和 BGC-823，细胞培养于含 10% 胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）和 1% 青霉素 / 链霉素溶液的 RPMI-1640 培养基中。选用 6 周龄雌性 BALB/c 裸鼠进行动物实验，动物实验经陆军军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。
3. 纳米颗粒表征：运用动态光散射（Dynamic Light Scattering，DLS）和激光多普勒测速仪测量纳米颗粒的大小、多分散指数（Polydispersity Index，PDI）和 zeta 电位；通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）观察纳米颗粒的形态；利用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）检测纳米颗粒中 DTX 的负载浓度。
4. 细胞实验：通过共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）观察 Cy5 标记的纳米颗粒被 HGC-27 细胞摄取的情况；构建 HGC-27 细胞来源的三维肿瘤球，观察纳米颗粒的渗透能力；采用划痕实验、Transwell 侵袭实验、细胞周期分析、CCK-8 实验、细胞凋亡实验、肿瘤球生长抑制实验以及 Western blot 分析等，研究纳米颗粒对胃癌细胞迁移、侵袭、细胞周期、增殖、凋亡等的影响。
5. 体内实验：建立 BGC-823 细胞荷瘤裸鼠模型，尾静脉注射 Cy5、Cy5 标记的纳米颗粒，利用体内成像系统检测纳米颗粒在体内的分布；将荷瘤裸鼠分组，分别给予 DTX、DTX/CA-Oxi-αCD NPs、DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 或生理盐水，测量肿瘤体积评估抗肿瘤效果，对肿瘤组织进行免疫组化分析和 TUNEL 检测，对主要器官进行苏木精 - 伊红（Hematoxylin–Eosin，H&E）染色 。
6. 统计分析：实验结果以至少三次独立实验的平均值 ± 标准差表示，使用 GraphPad Prism 9 软件进行统计分析，两组数据比较采用 Student’s t 检验，多组数据比较采用单因素方差分析（Analysis of Variance，ANOVA），以 p<0.05 为差异具有统计学意义。

三、研究结果

1. 细胞摄取和肿瘤球渗透：DLS 分析显示，DTX/CA-Oxi-αCD NPs 和 DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 的直径分别为 214.0 ± 7.6 nm 和 220.0 ± 5.1 nm，zeta 电位为负值，PDI 小于 0.2，TEM 图像证实其呈球形，且这些纳米颗粒在 pH 和 / 或 ROS 微环境下能智能释放药物。CLSM 结果表明，Cy5 标记的 CA-Oxi-αCD NPs 和 Cy5 标记的 FA-CA-Oxi-αCD NPs 均能被 HGC-27 细胞有效摄取，且 FA 修饰可增强细胞摄取，细胞摄取在 2 小时达到饱和。在三维肿瘤球实验中，两种纳米颗粒均能在肿瘤球中积累，FA 修饰的纳米颗粒积累量更多，且能深入肿瘤球内部。通过对肿瘤球切片的观察和荧光强度分析，进一步证实了 FA 修饰的纳米颗粒靶向胃癌细胞的能力更强。
2. 细胞迁移和侵袭评估：划痕实验和 Transwell 侵袭实验结果表明，DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 能显著抑制 HGC-27 细胞的迁移和侵袭，且效果优于 DTX/CA-Oxi-αCD NPs 和 DTX 单独处理组。这表明 FA 修饰的纳米颗粒通过增强靶向能力，更有效地抑制了胃癌细胞的迁移和侵袭，可能有助于降低胃癌的转移风险。
3. 细胞周期阻滞：流式细胞术分析显示，DTX/CA-Oxi-αCD NPs 和 DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 均能将 HGC-27 细胞阻滞在 G2/M 期，且 DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 组中处于 G2/M 期的细胞比例更高。Western blot 分析表明，两种纳米颗粒处理组中 TUBB3 蛋白表达均受到抑制，且 DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 组抑制作用更强。这说明 DTX 纳米疗法可能通过阻滞细胞周期在 G2/M 期发挥抗肿瘤作用，DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 在这方面效果更优。
4. 体外抗肿瘤疗效：CCK-8 实验表明，DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 对 HGC-27 细胞的毒性明显高于其他组，细胞活力随药物浓度增加和孵育时间延长而降低。流式细胞术检测细胞凋亡发现，纳米治疗组的凋亡细胞比例显著高于 DTX 组，DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 诱导的细胞凋亡效果最为显著。肿瘤球实验显示，DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 能明显抑制 HGC-27 肿瘤球的生长，且处理组中 ki67 表达最低，表明其对肿瘤细胞增殖的抑制作用最强。Western blot 分析发现，DTX 纳米颗粒处理组中 Bcl-2 蛋白表达受抑制，cleaved-caspase-3 蛋白表达增加，DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 组中 cleaved-caspase-3 蛋白表达最高。这一系列结果表明，DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 在体外具有良好的抗肿瘤效果，能抑制胃癌细胞增殖、促进凋亡。
5. 体内生物分布：选用 BGC-823 细胞进行体内实验，因为 HGC-27 细胞在体内成瘤存在一些问题，而 BGC-823 细胞与之相似且更易形成皮下肿瘤。尾静脉注射 Cy5、Cy5 标记的纳米颗粒后，体内成像显示，Cy5 标记的纳米颗粒在体内循环时间长，且 FA 修饰的纳米颗粒在肿瘤部位的荧光强度更高。对肿瘤组织和主要器官的荧光分析以及肿瘤切片的 CLSM 观察均表明，FA 修饰能增强纳米颗粒在体内对肿瘤组织的靶向能力，使其有效积累在肿瘤组织中。
6. 体内抗肿瘤疗效：荷瘤裸鼠实验显示，DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 在体内表现出最佳的抗肿瘤效果，能显著抑制肿瘤生长。T2 磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）显示该组肿瘤体积最小，信号强度高，提示可能存在药物诱导的水肿和肿瘤坏死。免疫组化染色和 TUNEL 检测表明，DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 组中 ki67 阳性染色最少，凋亡细胞最多，进一步证实其通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡来抑制胃癌生长。

四、研究结论与讨论

本研究制备了负载 DTX 且经 FA 修饰的 pH/ROS 双响应纳米颗粒 DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 用于胃癌治疗。体外实验证实，FA 修饰的纳米颗粒能被 HGC-27 细胞有效摄取，降低细胞活力并诱导凋亡，还能更深入地穿透三维肿瘤球，显著抑制肿瘤球生长，同时有效阻碍肿瘤细胞迁移和侵袭。体内实验表明，DTX/FA-CA-Oxi-αCD NPs 能有效在肿瘤部位积累，通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡，显著抑制肿瘤生长。

该研究成果意义重大。首先，为胃癌治疗提供了一种更有效的纳米治疗策略，有望提高胃癌患者的治疗效果和生存率。其次，这种 pH/ROS 双响应且靶向的纳米颗粒设计理念，为其他癌症的治疗研究提供了借鉴，推动了纳米医学在肿瘤治疗领域的发展。然而，该研究也存在一定局限性，比如纳米颗粒在体内的长期安全性和潜在的毒副作用还需进一步深入研究。未来，研究人员可在此基础上，进一步优化纳米颗粒的设计，开展更深入的临床前和临床试验，为将这一成果转化为临床应用奠定坚实基础，为广大胃癌患者带来新的希望。