《Molecular Cancer》单细胞 RNA 测序解锁 HR+/HER2 - 转移性乳腺癌对 CDK4/6 抑制剂耐药新密码，精准预测晚期进展生物标志物

为解决 HR+/HER2 - 转移性乳腺癌对 CDK4/6i 耐药及预测生物标志物不明的问题，美国德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心的研究人员开展相关研究，发现预测晚期进展的生物标志物。推荐科研读者阅读，助力探索更有效的治疗策略。

　　

美国德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心（The University of Texas MD Anderson Cancer Center）的研究人员 Linjie Luo、Peng Yang 等人在《Molecular Cancer》期刊上发表了题为 “Single?cell RNA sequencing identifies molecular biomarkers predicting late progression to CDK4/6 inhibition in patients with HR+/HER2? metastatic breast cancer” 的论文。该研究对于 HR+/HER2 - 转移性乳腺癌（mBC）的治疗和研究具有重要意义，为优化治疗策略、实现精准医疗提供了关键依据。

研究背景

乳腺癌（BC）是全球女性中最常见的非皮肤癌，其中激素受体阳性（HR+）、人表皮生长因子受体 2 阴性（HER2-）亚型占比超过 70%。约 30% 的早期乳腺癌患者最终会复发并发展为转移性疾病。对于 HR+/HER2 - 转移性乳腺癌患者而言，细胞周期蛋白依赖性激酶 4 和 6 抑制剂（CDK4/6is）与内分泌治疗联合已成为标准治疗方案。像美国食品药品监督管理局（FDA）批准的 palbociclib、ribociclib 和 abemaciclib 等 CDK4/6is，与单独内分泌治疗相比，能显著延长无进展生存期（PFS）。

然而，治疗过程中存在诸多挑战。约三分之一的患者在 6 个月内就会出现早期（内在）耐药，几乎所有患者最终都会产生获得性耐药。当前，寻找预测 CDK4/6i 疗效的生物标志物的研究虽多，但仍未找到可靠的指标。而且，现有研究对早期和晚期进展的机制区分不明确，缺乏区分早期进展者（EP）和晚期进展者（LP）的精确生物标志物，且大多集中于原发性肿瘤活检，对转移部位的研究有限。肿瘤微环境（TME，由多种肿瘤和非肿瘤细胞组成，影响肿瘤行为和治疗反应）的复杂性使得传统的批量测序难以全面捕捉肿瘤内部信息。此外，CDK4/6is 对肿瘤微环境中免疫细胞的影响也可能与耐药有关。因此，深入研究 HR+/HER2 - 转移性乳腺癌对 CDK4/6i 耐药的机制并寻找可靠的预测生物标志物迫在眉睫。

研究方法

1. 患者样本收集：从美国德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心接受治疗的 HR+/HER2 - 转移性乳腺癌患者处收集肿瘤活检样本，包括治疗前（基线，BL）和疾病进展时的样本。根据无进展生存期（PFS）将患者分为 EP（mPFS =3 个月）和 LP（mPFS =11 个月）。同时收集了 89 例 BL 样本用于验证研究，并从相关数据库获取患者的临床数据。

2. 样本制备与测序：新鲜肿瘤组织经胶原酶 A 消化等一系列处理后制备成单细胞悬液，进行基于液滴的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。此外，对新鲜组织和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行批量 RNA 测序（bulk RNA-seq）。

3. 数据分析方法：利用多种软件和算法对测序数据进行处理和分析。如用 CellRanger 进行初步处理，Seurat 包进行质量控制、归一化等操作；inferCNV 用于识别肿瘤细胞，Monocle 3 构建伪时间轨迹分析，fgsea 包进行通路分析等。还通过 Cibersortx 进行细胞类型反卷积分析，以推断细胞比例和估算基因表达。

研究结果

1. HR+/HER2- mBC 患者 TME 的转录组景观：通过 scRNA-seq 分析 83,222 个细胞，发现 BL 肿瘤细胞、EP 细胞和 LP 细胞的基因表达存在差异。BL 肿瘤细胞中 MGP、AZGP1 等基因表达升高，这些基因构成了预测 CDK4/6i 治疗结果的生物标志物面板。基因集富集分析（GSEA）显示，EP 和 LP 细胞的雌激素反应通路均减少，LP 样本的 PI3K、Myc 等通路活性增加，且 LP 细胞与 EP 细胞相比，炎症反应、KRAS 等通路活性也增强，表明不同阶段疾病进展的机制不同。

2. 肿瘤细胞中转移部位特异性基因表达模式：按转移部位（肝脏、胸腔积液、腹水和骨盆骨）对样本分类分析，发现不同转移部位的肿瘤细胞基因表达模式存在差异。如胸腔积液中 BL 和 EP 肿瘤细胞线粒体相关基因表达较高，LP 细胞 EMT 相关基因表达增加；肝脏转移中，BL 肝转移与胸腔积液不同，LP 肝转移细胞与细胞外外泌体、增殖相关的基因表达升高。同时，也找到了一些与转移部位无关的潜在预测生物标志物，如 TFF3 和 MGP。

3. HR+ mBC 治疗前后微环境中的非肿瘤细胞图谱：对非肿瘤细胞分析发现，BL 和 LP 样本中 CD8+ T 细胞和 NK 细胞频率显著高于 EP 样本，提示它们可能是预测 CDK4/6i 反应的生物标志物。T 细胞的 MP 分析表明，进展期肿瘤与 T 细胞功能障碍和细胞毒性降低有关。配体 - 受体（L-R）相互作用分析显示，EP 样本中 SPP1-CD44 等相互作用增强，LP 样本中 MDK-NCL 等相互作用增强，这些都有助于形成免疫抑制微环境。

4. BL 应答患者中 CD8 + 肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）增加且细胞应激和耗竭升高：对 T 细胞亚型分析发现，治疗后中央记忆 CD4+ T 细胞有增加趋势，BL 和 LP 样本中 CD8 + 效应记忆细胞显著增加。功能分析显示，BL 样本中 CD4 + 和 CD8+ T 细胞的应激 / 凋亡基因得分较高，且增殖的 CD8+ T 细胞也表达与应激和代谢相关的基因，提示对免疫检查点抑制剂可能存在耐药性。此外，还发现不同转移部位的 T 细胞组成和基因表达存在差异。

5. NK、B 和髓系细胞的转录谱：NK 细胞在 EP 样本中显著减少，LP 样本中 NK 细胞的细胞毒性和应激 / 凋亡水平高于 BL 样本。髓系细胞中，巨噬细胞数量在治疗后显著增加，cDC2 细胞减少，LP 样本中 M1 和 M2 巨噬细胞得分均高于 EP 样本。B 细胞中，LP 样本中记忆和幼稚 B 细胞频率低于 BL 样本。

6. HR+/HER2- mBC 患者 CDK4/6i 治疗前后纵向活检中肿瘤微环境的时间变化：对 1 例患者进行纵向研究发现，疾病进展时肿瘤细胞的 EMT、炎症反应等通路相关基因表达增加，免疫细胞中 NK 细胞和单核细胞 / 巨噬细胞比例显著增加，CD4 + 和 CD8+ T 细胞的细胞毒性功能增强，热休克和耗竭基因表达下调。

7. 在两个独立队列中验证 scRNA-seq 衍生的生物标志物：利用 scRNA-seq 分析确定的 13 个基因组成的生物标志物面板，在两个独立队列（美国德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心队列和韩国队列）中进行验证。通过批量 RNA-seq 数据和 Cibersortx 分析，结果显示该面板能有效预测临床结果，高评分组患者的无进展生存期显著延长。

8. 基因特征在临床和生物学背景中的广泛适用性：在不同临床背景（如新诊断未治疗患者、先前接受过化疗的患者）和不同组织部位（如乳腺肿瘤、骨和肝转移样本）中，该生物标志物面板均能有效预测无进展生存期。同时，不同内分泌治疗方案会影响基因表达模式，但该面板在不同治疗方案中均有效。此外，还验证了 NK 和 CD8+ T 细胞在应答者 BL 样本中的扩增。

研究结论与讨论

该研究通过单细胞 RNA 测序分析 HR+/HER2 - 转移性乳腺癌患者的肿瘤微环境，确定了预测 CDK4/6i 治疗晚期进展的分子生物标志物，并在两个独立队列中进行了验证。研究表明，肿瘤浸润的 CD8+ T 细胞和 NK 细胞可作为基线预测指标。同时，发现晚期进展者中 PI3K/AKT/mTOR 和 Myc 相关基因表达增加，炎症反应和 TNF-α 通路活性增强，揭示了肿瘤发生信号、炎症通路和免疫调节之间的相互作用在获得性耐药中的作用。

此外，研究还发现 BL T 细胞中应激相关基因和耗竭基因表达较高，提示肿瘤进展后对免疫治疗可能有更好的反应，为免疫治疗提供了新的思路。而且，研究确定的生物标志物面板在不同临床背景、组织部位和内分泌治疗方案中均具有预测能力，为个性化治疗提供了重要依据。

然而，该研究也存在一些局限性。样本量相对较小，纵向样本数量有限，影响了对转移部位特异性进展机制的研究；大多数患者接受 palbociclib 联合内分泌治疗，其他 CDK4/6is 对肿瘤微环境的影响有待进一步研究；研究未纳入 CDK4/6i 进展后接受替代疗法患者的样本，无法确定分子变化的特异性。

尽管如此，该研究为 HR+/HER2 - 转移性乳腺癌的治疗提供了有价值的见解，有助于指导临床治疗决策，推动个性化治疗的发展，未来还需进一步研究来验证和完善这些发现，以更好地改善患者的预后。