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为解决发展中国家 SMA 基因检测资源匮乏问题，印度尼西亚加查马达大学 Yogik Onky Silvana Wijaya 等人开展纤维素基卡片用于 SMA 基因检测研究。结果显示该卡片效果良好，能辅助诊断。推荐科研人员阅读，了解创新检测方案。
印度尼西亚加查马达大学（Universitas Gadjah Mada）医学院、公共卫生与护理学院生物化学系的 Yogik Onky Silvana Wijaya 等人在《BMC Biotechnology》期刊上发表了题为 “Performance of cellulose - based card for direct genetic testing of spinal muscular atrophy” 的论文。这篇论文在脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）的基因检测领域意义重大，为发展中国家，尤其是资源有限地区，提供了一种更具可行性的检测方案，有望改善 SMA 的诊断现状，减少误诊和诊断延误情况的发生。
研究背景
SMA 是一种极具破坏性的神经肌肉疾病，以运动神经元退化、肌肉无力和萎缩为主要特征，属于常染色体隐性遗传病。多数 SMA 患者的生存运动神经元 1（Survival Motor Neuron 1，SMN1）基因存在缺失或突变情况，而所有患者都保留着与之同源的生存运动神经元 2（Survival Motor Neuron 2，SMN2）基因 。这两个基因的差异主要体现在五个位置，其中外显子 7 的差异在 SMA 的发病机制中起着关键作用。因此，SMA 的分子诊断重点便聚焦于检测 SMN1 基因的外显子 7。目前，已有多种基因检测方法应用于 SMA 的诊断，包括单链构象多态性（Single - Stranded Conformation Polymorphism，SSCP）分析、限制性酶切分析、改良竞争性寡核苷酸引物聚合酶链反应（Modified Competitive Oligonucleotide Priming - Polymerase Chain Reaction，mCOP - PCR）、等位基因特异性扩增以及多重连接依赖探针扩增（Multiplex Ligation - Dependent Probe Amplification，MLPA）等。
随着新型药物的获批，早期进行 SMA 基因检测变得愈发重要。若能在症状出现前就给予患者药物治疗，可有效改善预后。为此，许多国家将 SMA 筛查纳入新生儿筛查政策，干燥血斑（Dried Blood Spot，DBS）因其制备、运输、储存和分析简便，成为了常用的检测样本来源。然而，像印度尼西亚这样的发展中国家，在开展 SMA 基因检测时面临诸多挑战。标准的滤纸，如 Guthrie 卡或 FTA 卡，虽然方便，但价格昂贵且难以获取，资源的匮乏以及冷链运输的复杂性，都限制了 SMA 基因检测在这些地区的开展。基于此，开发一种经济可行的替代滤纸用于 SMA 基因检测迫在眉睫。
研究方法
- 伦理审批与知情同意：研究获得了加查马达大学医学院、护理与公共卫生学院医学与健康研究伦理委员会（MHREC）的批准（参考编号 KE - FK - 0467 - EC - 2023，2023 年 3 月获批），所有参与者均签署了知情同意书，研究遵循世界医学协会《赫尔辛基宣言》的准则进行。
- 干燥血样制备：研究人员使用 180 gsm 的纤维素纸自制了纤维素基卡片。在使用前，将滤纸在 121°C、20 psi 的条件下高压灭菌 20 分钟，然后风干。标准的 FTA 卡从印度尼西亚雅加达的 Genetika Science 公司购买，作为对照标准卡片。从 20 名 SMA 患者和 42 名健康受试者身上采集 50 μL 全血，分别滴在纤维素基卡片和 FTA 卡上，室温下晾干 1 小时。之后，在滴有血斑的纤维素基卡片上添加 3 - 5 滴无水甲醇，但 FTA 卡上不添加。处理后的干燥血斑样本，即纤维素基卡片上的干燥血斑（Dried Blood Spots on the Cellulose - based Card，DBSc）和 FTA 卡上的干燥血斑（Dried Blood Spots on the FTA Card，DBSf），均在室温、避光且有干燥剂的环境下储存，直至进行分析。同时，研究人员还利用 FavorPrep? Blood/Cultured Cell Genomic DNA Extraction Mini Kit（Favorgen，中国台湾屏东）或 Sepagene Kit（Sanko Junyaku，日本东京），按照制造商的协议，从受试者剩余的全血中提取基因组脱氧核糖核酸（Genomic Deoxyribonucleic Acid，gDNA），并使用 NanoDrop 分光光度计（MaestroNano，中国台湾新竹）测定其浓度和纯度，gDNA 作为 PCR 比较的标准起始材料。
- 分子分析
- 聚合酶链反应 - 限制性片段长度多态性（PCR - RFLP）：为评估 DBSc 和 DBSf 用于直接常规 PCR - RFLP 的性能（即跳过 DNA 分离步骤），研究人员从 DBSc 和 DBSf 上分别取直径 1.2 mm 的血斑作为 PCR 模板，同时以 50 - 100 ng 的 gDNA 作为金标准模板。所有 PCR 反应均使用 KOD FX Neo?（Toyobo，日本大阪），反应总体积为 50 μL，包含 1X PCR 缓冲液、0.4 mM 的各 dNTP、0.3 μM 的各引物、1.0 U 的 KOD FX NEO 以及血斑模板或 gDNA。使用 T100 Thermal Cycler（Bio - Rad）或 Veriti? 96 - well Fast Thermal Cycler（Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific）进行热循环。首先分别对 SMN 外显子 7 和外显子 8 进行 PCR 扩增，扩增条件为：98°C 初始变性 2 分钟，然后 98°C 变性 10 秒、56°C 退火 30 秒、72°C 延伸 30 秒，共 40 个循环，最后 72°C 延伸 7 分钟。扩增后的 SMN 外显子 7 PCR 产物取 5 μL 进行 3% 琼脂糖凝胶电泳；15 μL 的 SMN 外显子 7 PCR 产物与 DraI 酶（New England Biolabs）和 1X 缓冲液混合，总体积为 20 μL，37°C 孵育过夜进行酶切；10 μL 的 SMN 外显子 8 PCR 产物与 DdeI 酶（New England Biolabs）混合，总体积为 12 μL，37°C 孵育过夜酶切。酶切后的产物再进行 4% 琼脂糖凝胶电泳。
- 多重等位基因特异性扩增 - 聚合酶链反应（Multi - ASA - PCR）：该实验通过同时扩增神经元凋亡抑制蛋白（Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein，NAIP）、SMN1 外显子 7 和囊性纤维化跨膜传导调节因子（Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator，CFTR）基因来评估 Multi - ASA - PCR 的性能。反应总体积为 50 μL，包含 NAIP、SMN1 外显子 7 和 CFTR 特异性引物对。反应条件为：98°C 初始变性 2 分钟，然后 98°C 变性 10 秒、60°C 退火 30 秒、72°C 延伸 30 秒，共 40 个循环，最后 72°C 延伸 7 分钟。5 μL 的 PCR 产物进行 3% 琼脂糖凝胶电泳。
研究结果
- 纤维素基卡片上的干燥血斑成功扩增出 SMN1：研究人员利用 PCR - RFLP 对 20 名已知 SMA 患者和 42 名健康对照者的 DBSc、DBSf 以及 gDNA 进行 SMN1 缺失检测，以分离 SMN1 和 SMN2。在直接 PCR - RFLP 实验中，跳过了从 DBSc 或 DBSf 中提取 DNA 的步骤，直接将血斑放入 PCR 反应混合物中进行扩增，缩短了基因检测的周转时间。实验结果显示，DBSc 的直接 PCR - RFLP 结果与 DBSf 和 gDNA 完全匹配，能够精确分离 SMN1 外显子 7 和 8 以及 SMN2 外显子 7 和 8。在琼脂糖凝胶电泳图谱中，健康个体的 DBSc 样本显示出未酶切的 187 bp 的 SMN1 外显子 7 片段和酶切后的 163 bp 的 SMN2 外显子 7 片段；而 SMA 患者的 DBSc 样本仅显示 163 bp 的 SMN2 外显子 7 片段。同样，健康个体的 DBSc 样本有清晰的 189 bp 的 SMN1 外显子 8 片段和酶切后的 123 bp、66 bp 的 SMN2 外显子 8 片段，SMA 患者的 DBSc 样本则只有 123 bp 和 66 bp 的 SMN2 外显子 8 片段。这表明纤维素基卡片具有作为 SMA 基因检测替代卡片的潜力。
- DBSc 适用于多重等位基因特异性扩增 - PCR（Multi - ASA - PCR）：研究人员进一步对 DBSc 进行 Multi - ASA - PCR 检测，同时扩增 NAIP、SMN1 外显子 7 和 CFTR 三个基因片段。CFTR 作为内参基因，用于确保反应中有模板存在，尤其是在严重 SMA 患者中，他们可能同时存在 NAIP 和 SMN1 缺失的情况。实验结果显示，健康受试者的样本能扩增出所有三个片段，而 SMA 患者的样本仅显示 NAIP 和 CFTR 两个片段，这与 PCR - RFLP 的结果一致，表明 Multi - ASA - PCR 用于 SMA 基因检测具有较高的准确性。此外，研究人员还发现一名健康受试者在 Multi - ASA - PCR 中出现 NAIP 片段缺失的情况。虽然 NAIP 基因缺失与严重 SMA 相关，但并非 SMA 患者所特有，在未患病个体或携带者父母中也可能低频出现，这表明仅 NAIP 缺失不足以导致疾病。不过，NAIP 缺失检测与 SMN1 缺失检测相结合，对于理解疾病严重程度和指导临床管理至关重要。
- 纤维素基卡片上干燥血斑储存时间的影响：研究人员从同一健康受试者定期制备新的 DBSc，并将其作为 PCR - RFLP 的模板，以确定 DBSc 是否能在一段时间内持续作为基于 PCR 的基因检测模板。结果发现，即使在储存 3 个月后，PCR - RFLP 的结果仍保持一致，健康受试者的 SMN1 和 SMN2 均能被成功扩增。这表明在适当的储存条件下（室温约 25°C，置于干燥、密封的拉链袋中，有硅胶干燥剂，并避光保存），纤维素基卡片上储存的 DNA 在至少 3 个月内保持稳定，可用于基于 PCR 的分析。不过，截至论文撰写时，储存时间的影响仍在持续研究中，目前尚未确定 DNA 在该纤维素基卡片上可稳定储存用于基因检测的最长时间。
研究结论与讨论
研究表明，自制的纤维素基卡片在 SMA 基因检测方面具有一定潜力，可作为替代 DNA 载体和储存工具。其物理特性和纤维密度与标准卡片相近，适合进行分子分析。通过优化的处理方法，如高压灭菌、使用 EDTA 作为抗凝剂以及甲醇固定等，有效抑制了 DNA 酶的活性，延长了血斑中 DNA 的储存时间。这种优化的替代 DBS 载体对于偏远地区，尤其是资源有限的地区进行 SMA 诊断具有重要意义，有助于减少诊断延误和误诊情况的发生。
然而，该纤维素基卡片也存在一定局限性。对于部分 SMA 患者，仅进行 SMN1 缺失检测是不够的，因为一些患者的剩余 SMN1 基因可能存在错义、无义、剪接位点和移码等多种突变，此时需要测定 SMN1 拷贝数并进行测序以查找有害突变。此外，目前的方法无法对 SMN1/SMN2 拷贝数进行定量分析，这限制了基于 DBSc 的 PCR 分析范围。与新兴技术 MLPA 相比，虽然 MLPA 能够同时识别 SMN1 缺失和定量 SMN1/SMN2 拷贝数，但 MLPA 成本较高，在资源有限的地区难以广泛应用。尽管如此，基于 DBSc 的 PCR 系统仍为 SMA 提供了一种可行的一线筛查方法，能够有效检测出 SMN1 缺失，这一疾病的标志性特征。这种经济高效的方法提高了 SMA 检测的可及性，有助于在偏远地区识别疑似 SMA 病例，对 SMA 的诊断和管理具有重要的推动作用。未来，还需要进一步研究评估 DBSc 在其他高通量方法、拷贝数分析或突变筛查中的性能，以完善其在 SMA 基因检测中的应用。
