工程化溶瘤病毒携抗 PD - 1 与阿仑膦酸钠：改写脑胶质瘤免疫治疗格局的前沿突破

为解决 GBM 治疗难题，徐州医科大学的研究人员开展 “工程化溶瘤病毒携抗 PD - 1 与阿仑膦酸钠治疗 GBM” 的研究，发现 PD - 1/Al@OV 可改善免疫微环境，增强抗肿瘤效果。该成果为 GBM 免疫治疗提供新策略，值得科研人员一读。

　　

徐州医科大学神经系统疾病研究所（Institute of Nervous System Diseases, Xuzhou Medical University）的研究人员 Yufu Zhu、Xuefeng Zhang 等在《Experimental Hematology & Oncology》期刊上发表了题为 “Engineered oncolytic virus coated with antiPD-1 and alendronate for ameliorating intratumoral T cell hypofunction” 的论文。这篇论文在脑胶质瘤（Glioblastoma，GBM）治疗领域具有重要意义，为免疫联合治疗和改善脑胶质瘤免疫微环境提供了新的策略，有望推动溶瘤病毒（Oncolytic viruses，OVs）在临床治疗中的应用。

一、研究背景

脑胶质瘤是一种极具侵袭性和破坏性的原发性脑肿瘤，常规治疗手段对其效果不佳。患者在接受手术、放化疗等多学科治疗后，中位生存期仅约 15 个月。溶瘤病毒作为一种新兴的治疗方式，能选择性地在癌细胞内复制并杀死癌细胞，同时引发抗肿瘤免疫反应，在脑胶质瘤治疗中展现出一定潜力。例如，溶瘤腺病毒 Delta 24 - RGD 已完成 I 期研究，部分患者实现了长期生存；G207、HSV1716 等也在美国和英国开展了针对脑胶质瘤患者的临床研究；日本更是批准了三重突变的溶瘤疱疹病毒 G47?用于临床治疗。

然而，溶瘤病毒单独治疗的疗效存在局限。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor - associated macrophages，TAMs）和小胶质细胞会限制溶瘤病毒的复制和传播，巨噬细胞能够吞噬并清除溶瘤病毒，降低其在脑胶质瘤中的滴度。TAMs 是脑胶质瘤微环境的重要组成部分，约占胶质瘤细胞的 30 - 50%，它能促进肿瘤细胞的增殖、存活和迁移，大量存在与患者预后不良相关。研究表明，减少 TAMs 的数量可抑制胶质瘤的侵袭和生长，因此，降低 TAMs 的含量成为抑制胶质瘤生长、增强溶瘤病毒疗效的潜在策略。阿仑膦酸钠（Alendronate，Al）作为一种双膦酸盐药物，能通过抑制 TAMs 的增殖和功能，显著抑制肿瘤进展和血管生成。

此外，溶瘤病毒感染虽能诱导促炎环境，促进 T 细胞募集，但会导致肿瘤细胞上免疫检查点配体 PD - L1 的表达上调，使募集的 T 细胞功能失调，产生对溶瘤免疫治疗的抵抗。PD - 1 是肿瘤浸润淋巴细胞细胞膜上的一种受体，其配体广泛存在于肿瘤相关巨噬细胞、树突状细胞、肿瘤细胞及细胞外基质中。PD - 1 与其配体结合后，会导致 T 细胞功能障碍或耗竭，减少细胞因子的产生，削弱其对肿瘤细胞的细胞毒性作用。阻断 PD - 1 与其配体的相互作用，可恢复 T 细胞功能，促进抗肿瘤免疫反应。研究显示，溶瘤病毒免疫治疗联合抗 PD - 1 抗体的效果明显优于单独使用溶瘤病毒免疫治疗。因此，将溶瘤病毒与免疫检查点抑制剂联合，可能是治疗脑胶质瘤患者的一种有前景的策略。

基于上述背景，本研究旨在开发一种用 ROS 响应性抗 PD - 1 和阿仑膦酸钠包被的溶瘤病毒（PD - 1/Al@OV），增强 T 细胞活性，防止溶瘤病毒被 TAMs 吞噬，以提高对脑胶质瘤的治疗效果。

二、研究方法

1. 构建治疗策略：开发一种纳米载体，利用重组腺病毒作为溶瘤病毒（OVs），以血清型 5 腺病毒为骨干，删除 E1B - 55kD 基因，并插入 EGFP 或 DsRed 基因，用阿仑膦酸钠和抗 PD - 1 包被，形成 PD - 1/Al@OV，旨在消耗 TAMs，增强免疫检查点阻断（Immune checkpoint blockade，ICB）治疗的反应性和效率。
2. 实验动物模型：在 GL261 和 U87 肿瘤模型中评估 PD - 1/Al@OV 的体内抗肿瘤效果。将小鼠随机分组，通过原位颅内注射将 PD - 1/Al@OV 给予荷瘤小鼠，监测肿瘤进展并绘制生存曲线。
3. 材料合成与制备：合成酰化阿仑膦酸钠和 ROS 响应性交联剂，制备 PD - 1/Al@OV 纳米载体，并对其进行表征。通过在不同条件下检测其稳定性、药物释放情况，评估 PD - 1/Al@OV 在模拟肿瘤微环境中的性能。
4. 细胞实验：使用多种细胞系，包括人胶质瘤细胞系 U87、U87 - GFP - Luci、U251、LN229、T98G，小鼠胶质瘤细胞系 GL261、GL261 - GFP - Luci，人星形胶质细胞系 HA1800，小鼠脑微血管内皮细胞系 bEnd.3，小鼠成纤维细胞系 Y2 和小鼠单核 / 巨噬细胞系 Raw264.7 等。进行免疫印迹分析（Immunoblot assay）、定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）、细胞计数试剂盒 - 8（CCK - 8）实验、5 - 乙炔基 - 2 - 脱氧尿苷（EdU）细胞增殖实验、酶联免疫吸附测定（ELISA）、流式细胞术分析（Flow cytometry analysis）等，检测细胞的感染能力、增殖能力、凋亡情况以及相关细胞因子的表达等。
5. 数据库分析：从 GlioVis 数据门户获取癌症基因组图谱计划（TCGA）数据，从 Gene Expression Omnibus（GEO）获取 GSE113510 数据集的基因表达和临床数据，从 GSE131928 提取单细胞 RNA 测序数据。使用 R 语言的相关包进行数据分析，评估 CD46 的表达水平与患者预后的关系。
6. 动物实验伦理：所有体内实验均获得徐州医科大学动物伦理委员会的批准，并在江苏动物保护协会的指导下进行，实验人员均具备江苏省实验动物专业技能证书。

三、研究结果

1. CD46 在胶质瘤中的表达及与预后的关系：研究人员利用 TCGA 数据库和单细胞数据（GSE131928）分析发现，CD46 在胶质瘤患者肿瘤组织中高表达，且高表达 CD46 与 GBM 患者预后不良相关。在间充质型 GBM 中，CD46 的表达高于前神经元型和经典型 GBM，提示其与干细胞的维持有关。qRT - PCR 和免疫印迹分析显示，CD46 的 mRNA 和蛋白表达水平在 WHO IV 级胶质瘤中最高。此外，通过流式细胞术分析不同胶质瘤细胞系发现，与柯萨奇腺病毒受体（CAR）相比，CD46 在 U87、GL261 等细胞系中表达较高，表明 CAR 在胶质瘤细胞上的表达定量不足，而本研究使用的嵌合纤维 Ad5/35 腺病毒可有效靶向并消除胶质瘤细胞。
2. PD - 1/Al@OV 的理化特性：成功合成了酰化阿仑膦酸钠和 ROS 响应性交联剂，并制备了 PD - 1/Al@OV。通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）检测发现，PD - 1/Al@OV 的平均粒径从裸病毒的 184.17 ± 12.89nm 增加到 326.53 ± 6.30nm，且保持了原始的单分散球形结构，表面 zeta 电位也有所增加。在脑脊液（CSF）中，PD - 1/Al@OV 能保持稳定。在高 ROS 环境下，PD - 1/Al@OV 能快速释放抗 PD - 1 和阿仑膦酸钠，12h 内阿仑膦酸钠释放量超过 76.4 ± 3.8%，抗 PD - 1 释放量超过 72.8 ± 2.8%，而在 PBS 中释放量均低于 10%。
3. PD - 1/Al@OV 的体外感染能力和抗肿瘤作用：通过对 U87、GL261 等胶质瘤细胞的感染实验发现，PD - 1/Al@OV 与 OVs 组的感染能力相似。CCK - 8 实验表明，PD - 1/Al@OV 和 OVs 对肿瘤细胞均具有剂量依赖性的细胞毒性作用，但对正常细胞（如 HA1800 和 bEnd.3）的细胞毒性较低。流式细胞术分析显示，PD - 1/Al@OV 处理 U87 和 GL261 细胞后，细胞凋亡率显著增加，与 OVs 处理组相近。EdU 实验表明，PD - 1/Al@OV 能有效抑制胶质瘤细胞的增殖。此外，CCK - 8 实验还发现，PD - 1/Al@OV 和阿仑膦酸钠均能抑制 Raw264.7 细胞（TAMs 模型细胞）的活性，表明 PD - 1/Al@OV 可有效消除 TAMs，且不影响 OVs 杀伤肿瘤细胞的能力。
4. PD - 1/Al@OV 在 C57BL/6J 小鼠中的病毒复制和抗肿瘤效果：在 C57BL/6J 小鼠原位 GBM 模型中，利用体内动物成像系统（IVIS）评估发现，PD - 1/Al@OV 在肿瘤组织中的存在时间明显长于裸病毒。对荷瘤小鼠进行不同处理后，监测肿瘤体积变化和小鼠生存时间。结果显示，PD - 1/Al@OV 组的抗肿瘤效果最佳，显著降低了荧光素酶信号，抑制了肿瘤生长。TUNEL 检测表明，PD - 1/Al@OV 能显著增强胶质瘤细胞的凋亡。PD - 1/Al@OV 处理组小鼠的中位生存时间最长，为 61.0 天，明显长于其他处理组。
5. PD - 1/Al@OV 对免疫系统的影响：在 C57BL/6 小鼠 GL261 胶质瘤模型中，通过流式细胞术和免疫组化分析发现，PD - 1/Al@OV 处理后，肿瘤组织中 F4/80 + CD11b + 巨噬细胞（TAMs）的数量显著减少，CD4 + 和 CD8 + T 细胞的浸润增加，调节性 T 细胞（Tregs，FOXP3 阳性细胞）的数量明显减少。ELISA 检测发现，PD - 1/Al@OV 处理后，肿瘤组织中抑制抗肿瘤免疫反应的 IL - 1β 和 IL - 6 水平显著降低，激活 CD8 + 细胞毒性 T 淋巴细胞的 IFN - γ 表达增加，表明 PD - 1/Al@OV 有效增强了抗肿瘤免疫反应。
6. PD - 1/Al@OV 在免疫缺陷小鼠中的作用：在缺乏 T 细胞的 BALB/c 裸鼠 U87/luci 细胞荷瘤模型中，PD - 1/Al@OV 和 OVs 的抗肿瘤效果相似，均能延长小鼠生存时间，但差异不显著。这表明在免疫缺陷小鼠中，抗 PD - 1 和阿仑膦酸钠可能无法发挥明显的治疗作用，凸显了免疫反应在载药病毒抗肿瘤效果中的重要性。
7. PD - 1/Al@OV 的体内毒性评估：对主要器官切片进行 H&E 染色和生化指标检测发现，PD - 1/Al@OV 组与 PBS 组相比，无明显异常，表明 PD - 1/Al@OV 在生物体内具有可靠的安全性。

四、研究结论与讨论

本研究成功开发了一种用 ROS 响应性抗 PD - 1 和阿仑膦酸钠包被溶瘤病毒的方法（PD - 1/Al@OV），有效改善了 GBM 的免疫抑制微环境，实现了强大的抗肿瘤效果。这种联合免疫治疗策略为 GBM 的治疗提供了新的思路和方法，为溶瘤病毒的临床应用开辟了新的前景。

GBM 是最常见且侵袭性最强的原发性恶性脑肿瘤，当前的标准治疗方法效果不佳且会损伤正常组织。肿瘤免疫治疗作为一种有前景的替代疗法，旨在利用免疫系统的天然细胞毒性能力攻击肿瘤。溶瘤病毒虽能引发抗肿瘤免疫反应，但在 GBM 这种 “冷肿瘤” 的免疫抑制微环境中，单药治疗效果受限。本研究制备的 PD - 1/Al@OV，通过在肿瘤高 ROS 环境下释放抗 PD - 1 和阿仑膦酸钠，分别阻断 PD - 1/PD - L1 通路激活 T 细胞、消除 TAMs 增加溶瘤病毒浓度，同时溶瘤病毒直接裂解癌细胞，促进肿瘤内 T 细胞浸润，从而改善免疫抑制微环境，增强抗肿瘤免疫反应，使 GBM 免疫治疗从 “冷” 状态转变为 “热” 状态。

研究人员还将进一步探索病毒在包封条件下的增殖情况，通过选择合适的细胞系和动物模型，全面评估病毒的增殖、分布和负载情况，为后续的病毒学研究和应用提供更深入的理解，优化病毒结构和功能，为开发新的抗肿瘤治疗药物和基因递送系统提供重要的研究方向。