新型 I 类 HDAC 抑制剂 IHCH9033 协同 FLT3 抑制剂：攻克 FLT3-ITD AML 耐药难题的前沿方案

为解决 FLT3-ITD AML 患者治疗效果不佳及耐药难题，上海临港实验室的研究人员开展关于 IHCH9033 与 FLT3 抑制剂联合治疗的研究，发现二者协同增效且能克服耐药。推荐科研读者阅读，以了解该领域前沿成果。

　　

上海临港实验室（Lingang Laboratory）的研究人员 Mingyue Yao 等人在《Experimental Hematology & Oncology》期刊上发表了题为 “IHCH9033, a novel class I HDAC inhibitor, synergizes with FLT3 inhibitor and rescues quizartinib resistance in FLT3?ITD AML via enhancing DNA damage response” 的论文。这篇论文在急性髓系白血病（AML，一种骨髓造血干细胞恶性克隆性疾病）治疗领域具有重要意义，为攻克 FLT3-ITD 突变型 AML 的治疗难题提供了新的方向和策略。

一、研究背景

急性髓系白血病（AML）是一种极具侵袭性的恶性肿瘤，其特征为未成熟髓系前体细胞的异常克隆性增殖，这会导致造血功能受损和骨髓衰竭。在 AML 患者中，常常出现异常的基因表达谱，而治疗的成功与否在很大程度上依赖于复发性的细胞遗传学和基因改变。其中，FMS 样酪氨酸激酶 3（FLT3）受体基因内部串联重复（ITD）突变是 AML 中一种突出的基因分子异常，约 25%-30% 的患者会受到影响。携带这种突变的患者白血病表型侵袭性强，往往早期复发，治疗效果不佳。尽管近年来治疗手段有所进步，但 FLT3-ITD 突变的 AML 患者长期生存率仍然很低。

目前，针对 FLT3-ITD AML 开发了多种小分子 FLT3 抑制剂（FLT3is），如 midostaurin 和 quizartinib 等。然而，这些抑制剂单药治疗时临床反应有限且短暂，大多数患者很快就会复发并产生耐药性。AML 中 CD34 + 细胞的存在常与白血病干细胞（LSCs）或前体细胞相关，这些细胞能够启动和维持白血病的发展。即使 FLT3 激酶活性被抑制，残留的 LSC 仍能逃避细胞死亡，导致酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗中断后疾病复发。因此，开发有效消除 FLT3-ITD AML 并克服 FLT3is 耐药性的新策略迫在眉睫。

表观遗传修饰失调是 AML 的一个关键特征，对其发病机制有着重要影响。AML 中修饰后的表观遗传状态和模式涉及 DNA 甲基化和组蛋白修饰改变，尤其是组蛋白去乙酰化，这会影响基因表达。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）负责调节组蛋白去乙酰化，其异常活性会导致基因表达失调和蛋白质功能异常，从而促进肿瘤发生并赋予白血病耐药性。过去 20 年，HDACs 的药理学抑制成为白血病临床前和临床研究的重点，一些 HDAC 抑制剂（HDACis），如 vorinostat、romidepsin 和 belinostat 等已被批准用于治疗皮肤 T 细胞淋巴瘤或外周 T 细胞淋巴瘤，pracinostat 也被授予治疗 AML 的孤儿药地位。但这些泛 HDACis 毒性高、疗效有限，限制了其临床应用。因此，开发亚型特异性 HDACis 成为提高白血病治疗效果、增强药效并降低毒性的合理策略。

虽然目前美国食品药品监督管理局（FDA）尚未批准选择性 I 类 HDACis，但已有多种化合物处于临床试验阶段，如 MGCD0103，中国也批准了 MS-275 和 tucidinostat 用于治疗外周 T 细胞淋巴瘤或与芳香化酶抑制剂联合治疗乳腺癌患者。HDACi 在 AML 早期临床试验中作为单药治疗显示出一定疗效，而在临床前和临床环境中与其他药物联合使用时，往往能展现出更有前景的抗肿瘤效果。此前研究表明，HDAC8 介导 TKI 耐药并促进 FLT3-ITD AML 的疾病维持，HDACi 还可诱导 FLT3ITD 的蛋白酶体降解。这些发现促使研究人员进一步探索 I 类选择性 HDACis 与 FLT3i 联合使用的抗白血病效果以及克服耐药性的潜力。

二、研究方法

1. 化合物：IHCH9033 由研究团队自行设计合成，quizartinib、MGCD0103 和 tucidinostat 购自 MedChem Express。所有化合物均溶解于二甲基亚砜（DMSO）配制成 10 mM 的储备液，并按推荐储存于 - 80°C。
2. 细胞系和培养：研究使用的 AML 细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）和德国微生物和细胞培养物保藏中心（DSMZ）。细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素 / 链霉素的 RPMI-1640 培养基中，于 37°C、5% CO?的环境下培养，并通过短串联重复序列分析进行细胞鉴定。Quizartinib 耐药细胞系（MV-4-11/quizartinib）通过在培养基中逐渐增加 quizartinib 浓度构建而成。此外，研究还收集了初诊 AML 患者的外周血或骨髓样本，经知情同意和伦理委员会批准后，分离单核细胞进行后续实验。
3. 细胞增殖分析：将细胞接种于 96 孔板，在含有不同浓度化合物的培养基中培养，然后加入 MTT 或 CCK8 试剂检测细胞增殖情况，使用 GraphPad Prism 8 计算抑制细胞生长 50% 的有效剂量（IC??）。对于联合治疗的细胞增殖分析，采用 HSA 模型协同分析，并使用 Synergyfinder 3.0 计算协同评分。
4. 蛋白检测相关实验：通过蛋白质免疫印迹（Western blot analysis）实验检测细胞裂解液中的蛋白水平；利用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）实验探究蛋白之间的相互作用；使用 2',7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）检测细胞内活性氧（ROS）积累水平；通过碘化丙啶（PI）免疫荧光染色评估 AML 细胞周期分布；采用 Annexin V-FITC/PI 染色检测细胞凋亡情况，并使用 CalcuSyn Demo Version 2.0 软件计算联合指数（CI）评估药物协同作用。
5. 基因检测相关实验：运用 RNA 测序（RNA-seq）分析基因表达变化，经反转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证相关基因的表达水平。
6. 体内研究：在动物实验中，将 AML 细胞皮下注射到雌性裸鼠体内构建荷瘤模型，待肿瘤体积达到一定大小时，对小鼠进行分组治疗，监测小鼠体重和肿瘤大小变化。此外，还构建了患者来源的异种移植（PDX）模型，将 AML 患者骨髓中的原代细胞注射到 NOG 小鼠体内，待白血病细胞在小鼠外周血中定植后进行治疗，并通过检测人 CD45 阳性（hCD45）或 hCD34 细胞来监测疾病进展。
7. 统计分析：利用 GraphPad Prism 软件进行数据可视化和统计分析，采用两尾无配对 Student's t 检验评估统计学意义，P 值小于 0.05 认为具有统计学差异。

三、研究结果

1. IHCH9033 抑制 FLT3-ITD AML 细胞 DNA 修复，诱导细胞凋亡：研究人员评估了 I 类 HDACis 对不同 FLT3 状态的 AML 细胞系的体外细胞毒性，发现 FLT3-ITD 细胞（MV-4-11 和 MOLM-13）对 IHCH9033 等 I 类 HDACis 的敏感性显著高于 FLT3 野生型（WT）和 FLT3-Null 细胞。IHCH9033 处理 FLT3-ITD 细胞后，导致细胞周期在 G0/G1 期阻滞并诱导细胞凋亡，同时增加了细胞内 ROS 水平。RNA-seq 分析和基因集富集分析（GSEA）显示，IHCH9033 处理后，DNA 修复相关基因集显著受抑制，凋亡相关基因集上调。进一步研究发现，IHCH9033 诱导了 DNA 损伤，下调了 DNA 修复蛋白 Ku70、TP53 和 RAD51 等的表达，抑制了 DNA 损伤传感器 ATM 及其下游修复信号，激活了 p53 乙酰化，最终导致细胞周期阻滞和凋亡。
2. IHCH9033 诱导 HSP90 乙酰化，促进 FLT3 降解：KEGG 分析显示，IHCH9033 处理 MV-4-11 细胞后，与 RAS/RAF/MAPK 信号通路相关的基因显著富集，该通路是 FLT3 的下游信号级联。Western blot 分析表明，IHCH9033 和 MGCD0103 处理仅在 FLT3-ITD AML 细胞中显著降低了 FLT3 及其下游靶点 AKT、STAT5 和 ERK 的磷酸化水平。IHCH9033 通过泛素化降解途径降低 FLT3 蛋白水平，且该作用可被蛋白酶体抑制剂 MG132 逆转。研究还发现，IHCH9033 诱导了热休克蛋白 90（HSP90）乙酰化，减少了 HSP90 与 FLT3 的相互作用，从而促进 FLT3 的蛋白酶体降解。
3. IHCH9033 在体内外对 FLT3-ITD AML 具有显著抗肿瘤活性：在 FLT3-ITD AML 细胞系构建的荷瘤小鼠模型中，IHCH9033 单药治疗显示出比 MGCD0103 和 tucidinostat 更强的体内抗肿瘤活性，且未引起小鼠体重明显变化。在原发性 AML 患者样本中，IHCH9033 对 FLT3-ITD AML 样本具有显著细胞毒性，对正常外周血单个核细胞（PBMCs）则无明显影响。同时，IHCH9033 增强了 DNA 损伤和细胞凋亡，降低了 STAT5、ERK 和 AKT 的磷酸化水平。
4. IHCH9033 与 quizartinib 联合治疗具有协同抗肿瘤效应：IHCH9033 与 FLT3i quizartinib 联合使用，在 FLT3-ITD AML 细胞系 MV-4-11 和 MOLM-13 中显示出显著的协同细胞毒性作用。联合治疗增强了细胞周期在 G0/G1 期的阻滞和细胞凋亡，增加了 DNA 损伤标记物 γH2AX 的表达，降低了 DNA 修复蛋白 Wee1 和 Rad51 的表达，进一步抑制了 FLT3 磷酸化和下游信号传导。在体内荷瘤小鼠模型中，联合治疗显著抑制了肿瘤生长，部分小鼠肿瘤完全消退，且未引起明显体重下降。在原发性 AML 患者样本中，联合治疗同样显著降低了细胞活力，增强了 DNA 损伤和细胞凋亡。
5. IHCH9033 克服 FLT3-ITD AML 对 FLT3i 的耐药性：研究人员构建了 FLT3i 耐药的 AML 细胞系 MV-4-11/quizartinib，发现该耐药细胞系对 I 类 HDACis 的敏感性高于亲本细胞。IHCH9033 和 MGCD0103 在体内外均能显著诱导 MV-4-11/quizartinib 细胞凋亡，降低 FLT3 信号通路的磷酸化水平，抑制 DNA 修复蛋白表达，诱导 DNA 损伤。IHCH9033 与 quizartinib 联合治疗在耐药细胞系中也显示出协同抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用，在体内显著抑制了耐药荷瘤小鼠的肿瘤生长。
6. IHCH9033 联合 quizartinib 有效清除 FLT3-ITD AML PDX 模型中的白血病负担：在老年 FLT3-ITD AML 患者来源的 PDX 模型中，quizartinib 单药治疗对白血病负担影响较小，而 IHCH9033 单药治疗或与 quizartinib 联合治疗显著降低了骨髓、脾脏和外周血中 hCD45 + 细胞和 / 或 hCD34 + CD45 + 细胞的比例，几乎完全清除了 AML 负担，且联合治疗耐受性良好，未引起小鼠体重下降和其他明显毒性反应。

四、研究结论与讨论

本研究表明，IHCH9033 作为一种新型 I 类 HDAC 抑制剂，在 FLT3-ITD AML 的治疗中展现出显著的抗肿瘤活性。它不仅能够有效作用于获得性耐药的 AML 细胞系和原发性耐药的患者样本，还能通过调节 DNA 损伤和修复反应发挥作用。IHCH9033 与 quizartinib 联合使用时，具有强大的协同效应，能够增强对 FLT3 及其下游信号通路的靶向调节，显著抑制肿瘤生长，甚至使肿瘤完全消退。这些发现为 I 类 HDACis 与 FLT3is 联合治疗 AML 提供了坚实的理论基础，为临床治疗 FLT3i 耐药的 AML 提供了一种有前景的新策略。

尽管目前 AML 的表观遗传治疗仍处于起步阶段，但具有巨大的发展潜力。单独使用 HDACis 治疗 AML 效果有限，然而联合治疗已显示出一定的疗效提升。本研究中，IHCH9033 无论是单药治疗还是与 quizartinib 联合治疗，都展现出令人期待的效果，尤其是在克服 FLT3i 耐药性方面。FLT3-ITD 突变会导致 ROS 产生增加，引发 DNA 损伤和修复错误，进而造成基因组不稳定和耐药。IHCH9033 通过增强 ROS 诱导的 DNA 损伤反应，调节 DNA 修复和损伤信号通路，使 DNA 损伤积累超过细胞修复能力，最终导致细胞凋亡。同时，它还通过促进 HSP90 乙酰化，破坏 HSP90 与 FLT3 的相互作用，促使 FLT3 通过泛素化途径降解，抑制下游信号传导。

临床上，FLT3is 治疗 AML 效果不理想，患者易复发且产生耐药性，主要原因包括治疗过程中出现的二次突变以及 HDAC8 等蛋白的上调。本研究发现，耐药细胞中 p53 表达降低，HDAC8 表达增加，这为理解耐药机制提供了新的视角。此外，HDACis 对耐药细胞具有较低的 IC??值和更强的体内抗肿瘤活性，表明 HDACis 有望成为治疗 AML，尤其是伴有 FLT3 二次突变患者的有效药物。

靶向 LSCs 对于改善 AML 临床结局和实现治愈具有重要意义，但目前相关治疗手段有限。本研究中，IHCH9033 单独或与 quizartinib 联合治疗在原发性 AML 细胞中显著降低细胞活力并诱导凋亡，对正常造血细胞毒性较小，且在 PDX 模型中有效减少了白血病负担，显示出良好的安全性。未来进一步研究 IHCH9033 对 AML LSCs 的作用，有望为 AML 治疗带来新的突破。

对于老年 AML 患者，尤其是不适合强化疗和干细胞移植的患者，预后往往较差。本研究通过建立 PDX 模型发现，IHCH9033 单独或联合 quizartinib 治疗几乎消除了白血病负担，为这部分患者的治疗带来了希望。然而，目前对 AML 表观遗传机制的理解仍不充分，需要进一步探索更多有效的抑制剂和联合治疗策略，以克服当前的耐药问题，改善患者的预后。

总之，这项研究成果为 AML 的治疗开辟了新的道路，有望在未来的临床实践中为患者带来更好的治疗效果和生存希望。