冷冻电镜揭示Bfu家族成员NfnABC中复合黄素双簇电子分岔位点的结构与机制

研究人员针对厌氧微生物代谢中关键的电子分岔酶BfuABC家族机制不明的科学问题，通过冷冻电镜解析了Caldicellulosiruptor saccharolyticus来源的NfnABC酶在结合NAD和铁氧还蛋白（Fd）前后的高分辨率结构，首次明确了由FMN、[4Fe-4S]（B1）和[2Fe-2S]（C1）簇组成的最小电子分岔位点（flavobicluster），揭示了NAD结合触发构象变化驱动电子分岔的分子机制，为理解该家族酶催化能量耦合反应提供了结构基础。

　　

在厌氧微生物的能量代谢中，电子分岔（Electron Bifurcation）是一种巧妙的能量转换机制，它能够将放能反应与吸能反应耦合，无需消耗ATP或依赖离子梯度。其中，BfuABC家族作为第四类电子分岔酶，以其独特的FMN（黄素单核苷酸）介导机制区别于其他三类FAD依赖的家族。然而，其电子分岔位点的精确组成与工作机制长期存在争议——早期研究认为需要多个铁硫（Fe-S）簇参与，但不同物种的结构研究却显示出令人困惑的差异性，特别是B2和B5位点究竟由[2Fe-2S]簇还是Zn²⁺占据的问题。

美国范安德尔研究所（Van Andel Institute）的Hua Li与Huilin Li团队选择嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptor saccharolyticus的NfnABC酶为研究对象，这种酶能催化NADPH氧化并同时还原NAD和铁氧还蛋白（Fd），在微生物高效产氢代谢中起关键作用。通过冷冻电镜解析2.7-3.3 ?分辨率的酶结构，研究人员首次发现该酶的B5位点被Zn²⁺占据（而非此前假设的[2Fe-2S]簇），从而将最小电子分岔位点精简为[B1-FMN-C1]复合黄素双簇。相关成果发表于《Communications Biology》。

研究采用冷冻电镜技术解析天然来源的NfnABC酶及其与NAD、Fd复合物的结构，结合ICP-MS金属含量分析和酶活测定，通过三维变异性分析（3DVA）捕捉构象动态变化。

结构与功能特征

冷冻电镜结构显示，NfnABC以四聚体形式存在，每个单体包含：

• NfnA：7个Fe-S簇（含非经典Lys配位的A7 [4Fe-4S]簇）和1个FAD

• NfnB：3个[4Fe-4S]簇（B1/B3/B4）、2个Zn²⁺（B2/B5位点）和1个FMN

• NfnC：1个[2Fe-2S]簇（C1）

  

电子传递路径

研究明确了从NADPH→FAD→A7-A6-A3-A2-A1→[B1-FMN-C1]的电子传递链，其中A7簇的非经典Lys配位可能调节其氧化还原电位以促进电子转移。

构象变化机制

NAD结合FMN后触发NfnB和NfnC的C端结构域（CTD）大规模重排，形成"三脚架"结构临时招募Fd：

1. 构象1：C1脱离黄素双簇形成[C1/B3/B4]三簇

2. 构象2：低电位电子通过三簇转移至Fd

3. 构象3：高电位电子保留在[B1/FMN]亚位点还原NAD

   

该研究不仅修正了Bfu家族酶的最小电子分岔位点模型，还揭示了Zn²⁺在维持结构稳定性中的重要作用。通过构象变化实现电子分岔与传递路径的时空隔离，这一机制为设计人工能量耦合系统提供了新思路，对理解微生物产氢代谢及开发生物能源技术具有指导意义。