无苯胺环境下RNA及其修饰与肼的化学反应性研究：质谱分析新策略

本研究针对RNA修饰检测中异构体区分的关键难题，开发了无苯胺肼处理结合质谱(MS)的分析方法。研究人员系统优化了反应条件，实现了尿苷(U)近完全转化(90%)而保持RNA完整性，成功区分假尿苷(Ψ)与U，并鉴定出8种修饰核苷(如s4U、mcm5s2U等)的肼反应产物。该技术为长读长测序和质谱检测RNA修饰提供了新工具。

　　

RNA修饰如同生命密码中的隐藏标记，调控着基因表达、蛋白质合成等核心生命活动。其中假尿苷(Ψ)作为最丰富的修饰，与癌症和神经系统疾病密切相关。然而，科学界长期面临一个棘手难题：Ψ与尿苷(U)这对"分子双胞胎"不仅质量相同，在测序中也难以区分。传统方法依赖苯胺诱导的RNA断裂，这严重限制了其在长读长测序中的应用。

法兰克福大学的研究团队在《Communications Chemistry》发表的研究中，创新性地开发了无苯胺肼处理技术。通过系统优化温度(0-50°C)、浓度(1-50%)和时间(1-24小时)，发现30%肼在0°C反应6小时可实现90% U转化且无RNA降解。MALDI-MS分析显示，处理后的tRNA^Phe中U39完全保留（实为Ψ），而其他U位点则出现52 Da质量差。高分辨质谱(HRMS)进一步鉴定出s⁴U、D等修饰的特异性反应产物，其中4-硫尿苷(s⁴U)通过C4亲核反应丢失硫原子，二氢尿苷(D)则发生开环反应。

关键技术包括：1) 梯度肼浓度处理RNA；2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)评估完整性；3) LC-MS/MS定量核苷转化率；4) MALDI-TOF和nano-LC HRMS分析寡核苷酸；5) 高精度TOF-MS鉴定反应产物结构。

【RNA完整性与尿苷转化验证】

体外转录的tRNA^Ile经50%肼处理24小时后，PAGE显示无降解片段。同位素稀释质谱证实仅U被转化(25%)，Ψ完全稳定，确立了反应特异性。

【反应条件优化】

温度实验揭示10°C以上会导致RNA降解，而0°C/50%肼处理6小时使U转化率达90%。值得注意的是，20°C处理时RNA迁移率改变源于尿苷12%的质量损失，而非断裂。

【质谱兼容性验证】

RNase T1消化后的tRNA经MALDI-MS检测，显示所有U位点均可被转化，包括高度结构化的茎区。NASE软件分析证实，HRMS能精确定位转化位点(如U5/U8)。

【修饰核苷反应特性】

低浓度肼(10%)即可完全清除s⁴U和mcm⁵s²U，而ac⁴C发生脱乙酰化。意外发现大肠杆菌tRNA中的t⁶A会被选择性降解，暗示存在未知催化因子。

这项研究突破了传统肼化学依赖苯胺的限制，为纳米孔测序和质谱分析提供了通用平台。特别是鉴定出m³C、s⁴U等修饰的特异性反应规律，解决了tRNA异形体修饰分析的难题。作者Nur Yesiltag-Tosun等强调，该方法未来可拓展至m⁵C/m³C的定位分析，为"修饰组学"研究开辟了新途径。